[发明专利]核苷酸组合物、试剂盒及其用途

说明书

本发明涉及核苷酸组合物、试剂盒用途及意义。利用该核苷酸组合物能够在一次检测中同时高灵敏和精确地检测出我国目前存在的各种基因型HBV，并且可以一次检测样品中的全部核酸，包括HBV DNA和RNA。这对于HBV DNA+RNA检测在指导慢性乙型肝炎抗病毒治疗具有极其重要的意义。此外，本发明中的核酸组合物可避免与其它病毒或人类基因发生非特异结合，进而防止了假基因的扩增，提高了检测的准确性。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及用于乙型肝炎病毒检测的核苷酸组合物及试剂盒以及它们的用途。

背景技术

在我国，乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染所致疾病仍是严重威胁国人健康的重大传染性疾病。全国现有慢性HBV感染者约7000万，其中慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者约2000万。

慢乙肝难以治愈和引起停药后病毒学反弹的主要原因是存在于感染肝细胞核内的病毒复制模板-HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)难以清除。因此，肝组织内HBV cccDNA的清除被认为是慢乙肝患者最接近完全治愈的标志。但由于HBV cccDNA的检测需要进行肝组织活检，限制了其在临床上的应用。目前，临床上多以乙肝表面抗原(HBsAg)消失和/或其抗体阳转作为评价慢乙肝“临床治愈”的标准。但现有的药物和治疗手段很少能使慢乙肝患者血清HBsAg阴转。为减少停药带来的病毒学反弹和疾病复发，各国的慢乙肝防治指南多强调患者需要长期甚至终生用药，而实际上约20％的患者停药后不发生反弹。因此，临床上仍缺乏甄别和确定慢乙肝患者安全停药的可靠指标。近年的研究表明，血清中的HBsAg不仅来自感染肝细胞核内的cccDNA，而且整合的HBV DNA片段也能转录翻译产生HBsAg(Cornberg M,etal.J Hepatol 2017,66:398-411；Rivkina MB,et al.Gene 1988,64:285-296；Kaplan PM,et al.J Virol 1976,17:885-893.)。因此，HBsAg不能很好反映肝组织内cccDNA的活性。

目前临床上已经常规定量检测血液中的HBV DNA，为诊断HBV感染及评价其抗病毒疗效提供了重要的检测手段。然而，血液中除了存在HBV DNA外，也存在HBV RNA。我们和其它课题组证实血液中的HBV RNA为包裹在病毒样颗粒内的未经或部分逆转录的前基因组RNA(Wang J,et al.J Hepatol 2016,65:700-710；Jansen L,et al.J Hepatol 2016,213:224-232.)，并且血液中的HBV RNA能很好地反映肝细胞内cccDNA的活性(Wang J,et al.JHepatol 2017,66:462-463；Giersch K,et al.J Heptol 2017,66:460-462.)。随着核苷(酸)类药物在抗病毒治疗中的广泛应用，HBV DNA的合成被有效阻断，血液中的HBV DNA水平经过一段时间抗病毒治疗后迅速下降并消失。然而，由于核苷(酸)类药物主要作用于HBV复制的逆转录过程，对于cccDNA转录形成HBV RNA无明显影响，因此，即使血液中检测不到HBV DNA，由于cccDNA的持续存在，血液中仍存在HBV RNA。所以，血液中HBV DNA和RNA均为HBV cccDNA存在和复制的标志，血液中HBV总核酸(HBV DNA+RNA)的定量检测显得尤为重要。

然而，目前针对HBV的基因检测主要集中于HBV DNA的检测。如果能够一次性检测出样品中HBV总核酸(DNA+RNA)，则对于评价慢乙肝患者抗病毒治疗的疗效和预后以及指导安全停药非常有利。然而，目前HBV基因的检测，或者仅检测DNA，或者仅检测RNA，例如中国专利申请公布CN105907891A公开了只检测pgRNA的方法。现有技术中没有公开能够一次性检测样品中HBV总核酸(DNA+RNA)的任何有效试剂，因此，迫切需要高度灵敏和精确的新型血液HBV总核酸检测方法。

发明内容