[发明专利]一种利用双功能融合酶Lip-EG1CD进行废纸脱墨的方法

权利要求书

1.一种利用双功能融合酶Lip-EG1CD进行废纸脱墨的方法，其特征在于，在废纸脱墨中使用的酶为双功能融合酶Lip-EG1CD，所述的双功能融合酶Lip-EG1CD为含内切型纤维素酶和脂肪酶活性的双功能融合酶Lip-EG1CD，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；包括以下步骤：

1)把废纸撕碎后放入5％浆浓的水桶里，常温浸泡，用ZQS 2打浆机疏解纸张，然后把纸浆用离心机甩干、分散纸浆、测浆料水分后储存于4℃条件下；

2)在反应容器中加入100mM pH 7.5磷酸钠缓冲液、水、纸浆、0.3％AEO-9、双功能融合酶，200rpm，35℃～55℃恒温震荡反应，反应结束后沸水灭活5min终止反应，取浆液用于测发色基团和还原糖释放量；

3)转移反应体系至浮选池，加入CaCl2、0.3％AEO-9和水，浮选10min，之后用自来水冲洗并用60目筛收集纸浆。

2.根据权利要求1利用双功能融合酶Lip-EG1CD进行废纸脱墨的方法，其特征在于，所述的双功能融合酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1利用双功能融合酶Lip-EG1CD进行废纸脱墨的方法，其特征在于，所述的双功能融合酶的用量为4.5-6.5nmol。

4.一种制备权利要求1所述的双功能融合酶Lip-EG1CD的方法，其特征在于，将内切型纤维素酶和脂肪酶通过linkers连接，获得融合基因，构建内切型纤维素酶和脂肪酶的融合基因的表达载体，并在Pichia pastoris中表达，获得双功能融合酶；包括以下步骤：

1)提取Thermomyces lanuginosus总RNA，采用引物5’-CGGCCTGTTCGACGAGCGGT-3’和引物5’-ATCACACTCTGAAATGGGAC-3’进行PCR扩增获得脂肪酶的cDNA全长，并将其亚克隆到pGEM-T上，随后采用引物5’-AGAGAGGCTGAAGCTGAATTCCGGCCTGTTCGACGAGCGGT-3’和引物5’-GAGATGAGTTTTTGTTCTAGAAATCAATGATGATGATGATGATGATCACACTCTGAAAT-3进行PCR扩增获得Lip基因序列；

2)以pBluescript-EG1质粒为模板，采用引物5’-TCCCCGCGGGGTGTCAACCAGGCTGGTGC-3’和引物5’-GCTCTAGATCAATGATGATGATGATGATGCACGAATGGTTTCAAAGCCT-3’进行PCR扩增获得EG1CD基因序列；

3)以Lip基因序列为模板，采用引物5’-AGAGAGGCTGAAGCTGAATTCCGGCCTGTTCGACGAGCGGT-3’和引物5’-AGGTGGGGTTGGGTGCGCTGCTGGTTGTCGTAGGTCCATCACACTCTGAAAT-3’进行PCR扩增获得融合酶Lip-EG1CD的Lip片段，以EG1CD基因序列为模板，采用引物5’-ACCCAACCCCACCTCCAGTGGCTGCCCGAATGCCACCAAGTTCAGATTCTTCGGT-3’和引物5’-GAGATGAGTTTTTGTTCTAGAAATCAATGATGATGATGATGATGCACGAATGGTTTCAA-3’进行PCR扩增获得融合酶Lip-EG1CD的含linker的EG1CD片段，以Lip和EG1CD基因序列为模板，采用引物5’-AGAGAGGCTGAAGCTGAATTCCGGCCTGTTCGACGAGCGGT-3’和引物5’-GAGATGAGTTTTTGTTCTAGAAATCAATGATGATGATGATGATGCACGAATGGTTTCAA-3’进行PCR扩增获得表达双功能融合酶基因序列；

4)将双功能融合酶基因序列与载体pPICZaA进行连接，转入巴斯德毕赤酵母KM71H，诱导表达，纯化酶液最终获得双功能融合酶。

5.权利要求4制备所述的双功能融合酶Lip-EG1CD的方法所获得的双功能融合酶Lip-EG1CD。