[发明专利]一种在蛹虫草中过表达菌丝霉素抗菌肽的方法

说明书

技术领域

本发明属于转基因技术领域，特别涉及一种在蛹虫草中过表达菌丝霉素抗菌肽的方法。

背景技术

抗菌肽是进化上高度保守、普遍存在的天然免疫系统因子，具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种生物学活性，且不易形成耐药性和药物残留。抗菌肽(Antibacterial peptides，ABPs)又称抗微生物肽(Antimicrobial peptides，AMPs)或宿主防御肽(host defense peptides，HDPs)，是生物体经诱导产生的具有广谱抗菌活性和免疫调节活性的一类小分子多肽，属于机体非特异性防御系统的固有组成部分，几乎存在于所有生命形式(昆虫、两栖动物、鸟类、鱼类、哺乳动物、植物以及人体)中。抗菌肽通常由12～50个氨基酸组成，相对分子质量一般在4kDa左右。研究发现，抗菌肽具有快速杀菌和广谱抗菌活性，包括抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、多重耐药细菌、真菌、寄生虫、包膜病毒和肿瘤细胞，并且能通过趋化树突状细胞、单核细胞和记忆T细胞，在先天性免疫和获得性免疫反应之间起到桥梁作用，并通过启动获得性免疫系统提高机体抵抗微生物感染的能力。迄今为止，已发现超过1500种抗菌肽。

菌丝霉素Plectasin是2005年从腐生子囊菌的分泌蛋白中分离出的首例真菌防御素。菌丝霉素的成熟功能片段只有40个氨基酸,其分子量约为4.4KDa，其空间结构由一个a螺旋和两个反相平行的β一折叠组成是典型的防御素CSaβ结构。其生物学活性主要表现为对革兰氏阳性菌有较强的杀菌作用，尤其是对肺炎链球菌、脓性链球菌、金黄色葡萄球菌等，有与青霉素、万古霉素相当的抗菌作用。此外，菌丝霉素在体外抑菌试验、动物试验及一些临床试验中表现出无细胞毒性、无溶血性、脑脊液渗透性好等优势，且不易使(包括对传统抗生素抵抗在内的)病原菌产生耐药性，因此作为新一代抗生素替代物具有相当大的治疗潜力。

作为传统中药，虫草的研究和应用一直备受关注。虫草是由子囊菌门(Ascomycoa)，肉座菌目(Hypocreales)，麦角菌科(Clavicipitaceae)虫草属(Cordyceps)真菌的孢子寄生于昆虫幼虫身上并由夏季从虫体生出子实体所形成的菌虫复合体。其中最著名的是寄生于高山蝙蝠蛾(Hepialusarmoricanus)幼虫的冬虫夏草(Ophiocordycepssinensis)和寄生于鳞翅目蛹的蛹虫草(Cordycepsmilitaris)(Sungetal.,2007)。虫草具有多种药用功效，包括：抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抗炎症、杀虫、抗微生物、降血脂血糖、抗衰老、神经保护、肾保护等功能，在肿瘤治疗、器官移植、肝肾移植和心脏保护等方面具有重要作用。其主要成分包括四类：1)核苷酸、2)多糖、3)多肽和糖蛋白、4)甾醇和萜烯。虫草素作为一种新型的广谱抗菌素有抗病毒、抗肿瘤作用。以其特有的抗菌抗病毒活性，已引起全球科技发达国家的高度重视。目前，我国蛹虫草产量达到市值15亿，包括直接食用及深加工产品。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种在蛹虫草中过表达菌丝霉素抗菌肽的方法，该方法得到的菌株与野生型菌株相比，对原核大肠杆菌和金黄的葡萄球菌有明显的抑菌作用，其具有替代抗生素的潜在利用价值。

本发明的一种在蛹虫草中过表达菌丝霉素抗菌肽的方法，包括：

(1)收集PDA上蛹虫草菌丝，提取DNA；利用引物扩增得到蛹虫草HSP70基因的启动子片段，将片段构建到PDHt-bar上，得到载体PDHt-HSP；

(2)合成菌丝霉素抗菌肽片段，酶切，连接到上述PDHt-HSP上，得到PDHt-HSP-ple载体；

(3)利用上述PDHt-HSP-ple载体转化农杆菌，将蛹虫草孢子和得到的农杆菌菌株共培养，经诱导和筛选得到转基因菌株。

所述步骤(1)中的HSP70基因的启动子片段的序列如SEQ ID NO.1所示。

所述步骤(1)中的引物为PR1：CGGAATTCCCCCTAAATCACAAGCTTGGTCCG；

PR2：TCCCCCGGGGTTGGCGGCTTCTGTGTGTGTA。

所述步骤(1)中的PDHt-bar的序列如SEQ ID NO.2所示。

所述步骤(2)中的菌丝霉素抗菌肽片段的序列(Ple序列)如SEQ ID NO.3所示。

所述步骤(2)中的合成菌丝霉素抗菌肽片段所用引物为

F：TCCCCCGGGATGGGCTTCGGCTGCAACGG；

R：CGGGATCCTTAGTAGCACTTGCAAACAAAAC。