[发明专利]炭黑曲霉转化黄芪甲苷制备6-O-葡萄糖-环黄芪醇的方法

说明书

本发明公开了炭黑曲霉转化黄芪甲苷制备6‑O‑葡萄糖‑环黄芪醇的方法,具体涉及一种利用炭黑曲霉(Aspergillus carbonarius.CICC 41254)在适量黄芪粉为诱导物的前提下，以黄芪甲苷为底物发酵转化制得6‑O‑葡萄糖‑环黄芪醇，并将发酵所得发酵液经水饱和正丁醇萃取、硅胶柱层析以及乙醇重结晶，最终得到纯度达到95％以上的6‑O‑葡萄糖‑环黄芪醇产品。本发明是利用微生物转化法制备6‑O‑葡萄糖‑环黄芪醇，其特点在于底物黄芪甲苷几乎全部转化，转化率高，方法简单易行，成本低，且对环境无污染，适合工业化生产。

技术领域

本发明属于医药化工领域，具体涉及一种利用炭黑曲霉转化黄芪甲苷制备6-O-葡萄糖-环黄芪醇的方法。

背景技术

黄芪是一味传统中药，其药用迄今已有2000多年的历史，具有增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用；环黄芪醇类皂苷是黄芪中药中的主要活性成分，属于环阿尔廷烷四环三萜类皂苷，具有加强免疫力、增加能量、抵抗疲劳、保护肝脏、清除自由基和抑制破骨细胞的作用，有很高的药用价值。

6-O-葡萄糖-环黄芪醇(CMG)属于环黄芪醇类皂苷，其结构由Isao Kitagawa于1983年首次报道，是通过橙皮苷酶水解黄芪甲苷得到。

中国已公开的专利申请中(中国专利申请公开号：CN1809364A)是以温和酸水解黄芪甲苷得到6-O-葡萄糖-环黄芪醇，但是反应得到的CMG的收率很低，仅有21％。且酸法制备的副产物多，其结构和大小与CMG类似，后期分离困难，不利于工业化生产。天津医科大学的夏广萍等人利用β-葡萄糖苷酶水解黄芪甲苷的到6-O-葡萄糖-环黄芪醇，转化率达到90％以上，但是相较于微生物转化法，酶法制备的成本较高，且商品化的β-葡萄糖苷酶也并非黄芪甲苷特异性水解酶(夏广萍,刘鹏,等.β-葡萄糖苷酶水解黄芪甲苷的研究[J].中草药,2012,43(6):1112－1114.

6-O-葡萄糖-环黄芪醇(CMG)结构

发明内容

本发明的目的在于选择采用一种微生物转化的方法来转化黄芪甲苷得到6-O-葡萄糖-环黄芪醇，克服现有6-O-葡萄糖-环黄芪醇制备技术中副产物多，转化率效率低，成本高，污染环境等缺点。本发明根据现有技术的不足作出创新和改进，提供一种高效的生物法制备6-O-葡萄糖-环黄芪醇的方法。

为实现上述发明目的，所采用的技术方案是：

A.种子液制备

将炭黑曲霉冻干粉经试管斜面活化培养后转移至PDA平面培养基中，再向平面培养基中加入无菌水制成孢子浓度为6×10⁸个/mL炭黑曲霉孢子悬浮液。

B.发酵转化

将步骤A中的炭黑曲霉孢子悬浮液接种至液体发酵培养基中，置于摇床温度为28～30℃、摇床转速为180r/min的条件下培养6天，获得发酵液。

C.分离纯化

将步骤B中的发酵液经由水饱和正丁醇萃取三次后真空浓缩蒸干得到萃取产品，进一步利用硅胶柱层析分离纯化，最终通过乙醇重结晶将产品的纯度提高到95％以上，得到6-O-葡萄糖-环黄芪醇产品。

上述步骤B中的发酵培养基配方为：底物黄芪甲苷的浓度为1mg/mL，黄芪粉浓度为2g/L，酵母粉浓度为10g/L，硫酸铵浓度为2g/L，KH₂PO₄浓度为4g/L，MgSO₄·7H₂O浓度为1g/L，吐温80体积百分比为0.1％，初始pH值为4.5，接种量和发酵培养基的体积比为1:100。

上述步骤B中的黄芪粉为80目的黄芪粉，是直接将洗净的黄芪根茎粉碎制成，在发酵过程中主要用来诱导炭黑曲霉产酶。