[发明专利]一种快速提取果梅花芽中蛋白质的方法

说明书

本发明公开了一种快速提取果梅花芽中蛋白质的方法，以25‑30mg果梅花芽为原料，液氮研磨至粉末；加入100‑150μL SDS缓冲液研磨至匀浆，4‑10℃、8000‑12000g短暂离心30‑60秒，煮沸5‑8min，4‑10℃、8000‑12000g离心10‑15分钟，上清即梅组织中的蛋白质。本发明方法提取得到的蛋白质用于Western‑blot、ChIP试验的应用。相较于这些传统方法，本发明方法只需要25‑30mg的果梅花芽材料，整个提取过程只需要30分钟，大大减少了样品的使用量及提取时间。

技术领域

本发明涉及一种快速提取果梅花芽中蛋白质的方法，专用于Western-blot、ChIP等蛋白试验。

背景技术

果树分子生物学领域的研究越来越深入，然而长期以来，由于果树木本植物的特性，其蛋白质的提取过程十分复杂耗时，因此进一步进行Western-blot、ChIP等试验显得尤为困难。Western-blot(Western印迹技术)，也称Western杂交技术，是一种常见的半定量分析生物组织蛋白质表达的方法，是蛋白质分析的常用分子生物学技术之一。

果梅(Prunus mume Sieb et Zucc)属蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus L.)，原产中国，是我国的特色树种，亦是我国重要的创汇果树。花是果树重要的生殖器官，在梅产量形成中具有重要意义。研究花芽发育过程的蛋白质组学，是进一步揭示梅花器官的形成和发育以及休眠机制的有效手段。目前，鲜有关于梅Western-blot研究的报道，从梅组织中提取高质量的总蛋白，是开展梅Western-blot技术研究的前提。关于梅组织总蛋白质的提取已有文献报道^[1]，一般传统方法如TCA/丙酮沉淀法、酚抽法及Tris-HCl法，梅组织用量较多，实验操作较繁杂、耗时长、成本高，提取得到的蛋白质也仅用于梅双向电泳分析，蛋白质双向电泳图谱结果背景较高、非特异性条带较多。

[1]庄维兵,高志红,章镇,侍婷,邵静.果梅花芽蛋白质双向电泳优化体系的建立.南京农业大学学报.2011,34(6):47-52.

发明内容

技术问题

本发明的目的在于解决现有果树中通用的蛋白质提取方法十分繁琐耗时，无法为果树蛋白质组学进一步研究提供技术支持，针对深入研究果梅蛋白质组学的需求，本发明从蛋白提取所需样品量、提取液配方、提取的时间等方面进行了优化改良，建立了一套快速、特异、灵敏地提取梅组织蛋白质的方法，为梅组织中蛋白质的Western-blot、ChIP等试验奠定了基础。

技术方案

一种快速提取果梅花芽中蛋白质的方法，包括以下步骤：

(1)、以25-30mg果梅花芽为原料，液氮研磨至粉末；

(2)、加入100-150μL SDS缓冲液研磨至匀浆，4-10℃、8000-12000g短暂离心30-60秒，煮沸5-8min，4-10℃、8000-12000g离心10-15分钟，上清即梅组织中的蛋白质。

步骤(2)中，所述的SDS缓冲液为：pH 6.8的1.0mol/L Tris-HCl 1.0mL，10％(w/v)SDS溶液4.0mL，1％(w/v)溴酚蓝0.05mL，甘油2.0mL，50μLβ-巯基乙醇，双蒸水定容至20mL。SDS缓冲液包括了提取液(pH 6.8的1.0mol/L Tris-HCl 1.0mL)、裂解液(10％SDS溶液4.0mL)以及上样指示液(1％溴酚蓝0.05mL)，因此，在完成蛋白质快速提取后，直接上样跑胶，没有干燥纯化等待的时间，一步到位。

优选的，步骤(2)中，加入100-150μL SDS缓冲液研磨至匀浆，4℃、8 000g短暂离心30秒，煮沸5min，4℃、12 000g离心15min，上清即梅组织中的蛋白质。