[发明专利]一种克氏原螯虾染色体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物细胞实验技术领域，具体涉及一种克氏原螯虾染色体的制备方法。

背景技术

克氏原螯虾(Procambarus clarkii)，隶属于甲壳纲，十足目，螯虾科，原螯虾属，原产于墨西哥北部和美国南部。于1929年左右引入我国，目前该虾已成为我国一种重要的水产养殖动物，为我国的经济作出了一定的贡献。了解该虾的染色体组型特征可以为进一步研究该虾的遗传育种与品种改良以及控制奠定一定的理论基础。

由于克氏原螯虾的染色体形态较小、数目较多，一般的染色体制备方法很难得到分散好、形态清晰可辨的染色体图片，这给克氏原螯虾的组型分析带来一定的困难。已有三篇文献报道了克氏原螯虾的染色体研究情况，其中只有最早的一篇文献给出了该虾染色体的组型分析结果(Murofushi et al.Karyological study of the red swamp crayfish and the Japanese lobster by air-drying method.Proc.Japan Acad.,Ser.B,1984,60(B):306-309)，另两篇文献只给出了染色体分裂相的图片，因染色体形态可辨性差没有进一步给出组型分析结果(朱越雄等，克氏原螯虾染色体研究.水产养殖，1997，3：1-13；2.Radwan et al.Cytogenetic characterization and genetic variations between freshwater crayfish Procambarus clarkii in Egypt.RJPBCS,2014,5(2):1801-1816)。这三篇文献给出的克氏原螯虾染色体数目上存在一定的出入，文献提到的制备染色体的组织多为精巢，而只有当精巢处于生殖发育期才易得到中期分裂相。现有的方法限制了采样的时间。因此，寻找一种更适合该虾染色体的制备方法，且样本采集时间不受季节限制，可为该虾染色体数目的确定及其组型分析等研究奠定基础。

发明内容

本发明的目的是针对克氏原螯虾染色体较小、数量较多、不易得到分散好的染色体分裂中期相、样本采集时间受限制等问题，提供一种染色体分散好，形态可辨且可数的改进的克氏原螯虾染色体的制备方法，本发明涉及的样本采集时间不受季节的限制。

实现本发明的技术方案如下：

一种克氏原螯虾染色体制备方法，包括以下步骤：

(1)前期处理：按照克氏原螯虾虾体重6ug/g的剂量向肌肉内注射植物血凝素(PHA)，间隔12h后按同样剂量注射第二次，间隔3h后按5ug/g克氏原螯虾虾体重的剂量注射1mg/mL的秋水仙素，注射秋水仙素4h后取样；

(2)利用离心法制备细胞：取虾的触角腺组织，置于生理盐水中漂洗，然后放入有500uL生理盐水的1.5mL离心管中，用小剪子将组织剪碎成泥状，全部移入10mL试管，在500r/min下离心3min，离心后取上清液，在1000r/min下离心10min，弃上清液；

(3)低渗、预固定：用滴管将细胞吹散，缓慢加入0.75％KCl溶液至5mL，室温下放置30min后加1mL的固定液-1，在1000r/min下离心10min，弃去上清液，留少许上清液，将细胞吹散；

(4)固定：加入5mL的固定液-1固定1.5h，中间更换3次固定液-1，每次在1000r/min下离心10min，最后一次留少许上清液，将细胞缓慢吹散后，加入适量固定液-2，将细胞混合均匀，30min后制片；

(5)喷片：将预冷的载玻片斜放，用滴管吸取适量的细胞悬液，垂直快而有力的喷到载玻片上，酒精灯火焰上快速烤2-3s后，在空气下干燥；

(6)染色：采用瑞士-姬姆萨染色套组(购自武汉谷歌生物科技有限公司)，该染色套组分A液和B液，按A液和B液体积比为1:2配制)对附着有染色体的玻片进行染色；

(7)在显微镜下观察和拍照；

其中：

步骤(2)中的生理盐水组分为：NaCl 7.5g/L，CaCl₂ 0.2g/L，KCl 0.2g/L，NaHCO₂0.02g/L；

步骤(4)中的固定液-1为甲醇和冰醋酸按3:1体积比进行配制；固定液-2为甲醇和冰醋酸按照1:1体积比进行配制。固定液-1和固定液-2现用现配，置于冰上备用。

本发明具有以下优点：