[发明专利]微生物核酸的定性和定量检测

权利要求书

1.一种用于同时检测及量化生物学样品中的微生物核酸的方法，所述方法包括：

a)分离并纯化所述微生物核酸，

b)提供反应混合物，其包含至少第一对照核酸、与所述微生物核酸的独特序列部分以及与所述对照核酸的独特序列部分特异性杂交的一种或多种引物对、和与每一种由所述一种或多种引物对扩增的序列特异性杂交的探针，其中所述微生物核酸和所述对照核酸与不同探针杂交，

c)向所述反应混合物添加所述生物学样品，

d)实施一个或多个循环步骤，其中循环步骤包括扩增步骤，所述扩增步骤包括若所述微生物核酸存在于所述样品中，则生成一种或多种自所述微生物核酸衍生的扩增产物，并且生成自所述对照核酸衍生的扩增产物，且其中循环步骤包括杂交步骤，所述杂交步骤包括使由所述引物对扩增的序列与所述探针杂交，其中所述探针用供体荧光模块和相应的接受荧光模块标记，且每种探针携带不同荧光染料，

e)检测及测量由所述扩增产物生成并且与所述对照核酸和所述微生物核酸的浓度成比例的荧光信号，其中所述对照核酸的扩增产物的存在即使在缺乏所述微生物核酸的扩增产物的情况中指示所述反应混合物中发生扩增。

2.权利要求1的方法，其中依照不同标准来分析所述第一对照核酸以充当定量标准核酸或定性内部对照核酸。

3.一种用于同时检测及量化生物学样品中的微生物核酸的方法，所述方法包括：

a)分离并纯化所述微生物核酸，

b)提供反应混合物，其包含不同浓度的第一和第二对照核酸、与所述微生物核酸的独特序列部分以及与所述对照核酸的独特序列部分特异性杂交的一种或多种引物对、和与每一种由所述一种或多种引物对扩增的序列特异性杂交的探针，其中所述微生物核酸和所述第一对照核酸和所述第二对照核酸与不同探针杂交，

c)向所述反应混合物添加所述生物学样品，

d)实施一个或多个循环步骤，其中循环步骤包括扩增步骤，所述扩增步骤包括若所述微生物核酸存在于所述样品中，则生成一种或多种自所述微生物核酸衍生的扩增产物，并且生成自所述第一对照核酸和所述第二对照核酸衍生的扩增产物，且其中循环步骤包括杂交步骤，所述杂交步骤包括使由所述引物对扩增的序列与所述探针杂交，其中所述探针用供体荧光模块和相应的接受荧光模块标记，且每种探针携带不同荧光染料，

e)检测及测量由所述第一对照核酸和所述微生物核酸的扩增产物生成并与其浓度成比例的荧光信号，和/或同时检测由所述第二对照核酸的所述扩增产物生成的荧光信号，其中所述第二对照核酸的扩增产物的存在即使在缺乏所述微生物核酸的扩增产物的情况中指示所述反应混合物中发生扩增。

4.权利要求3的方法，其中所述第一对照核酸是定量标准核酸，而所述第二对照核酸是定性内部对照核酸。

5.前述权利要求中任一项的方法，进一步包括

在步骤e)中通过比较由所述微生物核酸和所述第一对照核酸生成的信号来测定所述生物学样品中所述微生物核酸的数量。

6.前述权利要求中任一项的方法，其中扩增采用具有5’至3’外切核酸酶活性的酶聚合酶。

7.权利要求3的方法，其中所述第一对照核酸以所述微生物核酸的检测限的20-5000倍的浓度存在，且其中所述第二对照核酸以所述微生物核酸的检测限的1-25倍的浓度存在。

8.权利要求3的方法，其中在一种对照试剂内提供所述第一和所述第二对照核酸。

9.不同浓度的第一和第二对照核酸用于通过实时PCR来同时检测及量化微生物核酸的用途。

10.权利要求9的用途，其中所述第一和第二对照核酸通过相同引物对或不同引物对来扩增，但是与不同探针杂交。

11.一种用于通过实时PCR来同时检测及量化生物学样品中的微生物核酸的试剂盒，所述试剂盒包含不同浓度的第一和第二对照核酸、与所述微生物核酸的独特序列部分以及与所述第一和第二对照核酸的独特序列部分特异性杂交的一种或多种引物对、和与每一种由所述一种或多种引物对扩增的序列特异性杂交的探针，其中在一种对照试剂内提供所述第一和第二对照核酸。