[发明专利]一种血管化组织工程骨及其制备方法

权利要求书

1.一种血管化组织工程骨，其特征在于其是由多聚赖氨酸修饰的珊瑚羟基磷灰石构成的支架以及依次包裹在所述支架表面的成血管内皮细胞膜片和成骨细胞膜片构成，其中用于制备所述成血管内皮细胞膜片的内皮细胞和用于制备成骨细胞膜片的成骨细胞均来源于脂肪间充质干细胞，具体工艺过程为：

1）多聚赖氨酸修饰的珊瑚羟基磷灰石的制备

将珊瑚羟基磷灰石用质量浓度为0.25%～1.25%的多聚赖氨酸溶液在0～4℃温度条件下浸泡15～24h，之后负压抽滤，置-20℃冰箱冷冻过夜，冷冻干燥即可；

2）成骨细胞膜片的制备

将第三代或第四代脂肪间充质干细胞先用胰蛋白酶消化，然后用DMEM/F12培养基终止消化，按1×10⁶～3×10⁶ 个/cm²的密度接种至培养皿中，加入含10～12%胎牛血清和1～1.5%双抗的DMEM/F12培养基上，置于37℃，5％ CO₂恒温培养箱中培养24～48h，然后再用成骨细胞诱导培养液培养10～14天即可；

3）成血管内皮细胞膜片的制备

取第三代或第四代脂肪间充质干细胞按2×10⁶～4×10⁶ 个/cm²的密度接种于含10～12%胎牛血清和1～1.5%双抗的DMEM/F12培养基中培养24～48h，然后再用血管内皮细胞诱导液持续培养10～14天即可；

4）血管化组织工程骨的构建

将过程3）所得的成血管内皮细胞膜片缠绕在过程1）所得的多聚赖氨酸修饰的珊瑚羟基磷灰石支架表面，包裹一圈，然后将过程2）所得的成骨细胞膜片包绕在上述成血管内皮细胞膜片外面，包绕一圈，形成卷层样复合体，以丝线缠绕固定。

2.按照权利要求1所述的血管化组织工程骨，其特征在于过程1）中，每3小时震荡摇匀浸泡液。

3.按照权利要求1所述的血管化组织工程骨，其特征在于过程1）中，所述负压抽滤至未见任何气泡自珊瑚羟基磷灰石表面孔隙溢出即可。

4.按照权利要求1所述的血管化组织工程骨，其特征在于过程1）中，所述冷冻干燥是指：将冷冻过夜后的以多聚赖氨酸溶液浸泡的珊瑚羟基磷灰石放入冷冻干燥机内，在温度-42℃～-47℃、负压20-28Pa条件下，预冷30min后开始抽真空，控制真空度25～28Pa，冷冻干燥48～72h。

5.按照权利要求1所述的血管化组织工程骨，其特征在于过程2）中，所述成骨细胞诱导培养液组成为：DMEM/F12培养基170～180ml，胎牛血清 17～22ml，双抗1.7～2.7ml，谷氨酰胺2～3ml，抗坏血酸550～580ul，β-甘油磷酸钠 2～3ml，地塞米松15～25ul。

6.按照权利要求1所述的血管化组织工程骨，其特征在于过程2）中，用诱导培养液培养时，隔日换液培养。

7.按照权利要求1所述的血管化组织工程骨，其特征在于过程3）中，所述血管内皮细胞诱导液组成为：内皮细胞生长培养基90～110ml，胎牛血清 4.5～5.5ml, 维生素C 0.09～0.11ml, 庆大霉素-两性霉素B 0.09～0.11ml, 氢化可的松0.036～0.044ml, 人表皮生长因子0.09～0.11ml, 人成纤维细胞生长因子0.45～0.55ml, 类胰岛素一号增长因子0.09～0.11ml,血管内皮细胞生长因子0.09～0.11ml。

8.按照权利要求1所述的血管化组织工程骨，其特征在于过程3）中，用血管内皮细胞诱导液培养过程中，隔2-3天换液培养。

9.按照权利要求1所述的血管化组织工程骨，其特征在于过程4）中，所述多聚赖氨酸修饰的珊瑚羟基磷灰石支架在使用前用含10～12%胎牛血清和1～1.5%双抗的DMEM/F12培养基浸泡12～24h。