[发明专利]用于检测InhibinB含量的流式检测试剂及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及血清或精浆中Inhibin B(抑制素B)含量的检测技术，尤其是涉及一种用于检测Inhibin B含量的流式检测试剂及其制备方法和应用。

背景技术

抑制素B(INH B)是转化生长因子β超家族成员之一，属于糖蛋白激素；由α和β_B两个亚单位通过二硫键相连组成异二聚体(α-βB)，仅二聚体才有生物学活性。人们认为抑制素结合蛋白(INHBP)和Ⅲ型转化生长因子β受体(TGFβRⅢ)是INH B受体。INH B 主要有以下功能：①通过拮抗Ⅱ型受体(typeⅡreceptors)调节活化素的生理功能。但仅在活化素反应的情况下具有活性。②调控与反映支持细胞功能，作为监测睾丸功能及评估精子发生的指标之一。③参与垂体功能的调节。从青春期开始血清INH B与卵泡刺激素(FSH)形成稳定的负反馈调控关系，而且在精曲小管功能正常情况下是主要的来自性腺的调节因素。

INHB在临床上具有非常重要的参考作用，主要通过以下几个方面来表现：①INH B 与精子发生障碍有重要联系。因为INH B绝大部分来自睾丸支持细胞及各级生精细胞，因此INH B和精子发生状态、精子计数呈正相关。认为血清中INH B是精子发生的血清标志物。精子发生功能受损时，血清INH B水平下降。此外，不育男性的间质细胞受损，功能降低，其产生INH B的β_B亚单位较少，也是血清INH B水平下降原因之一。目前认为，以抑制素B极显著降低和FSH 3倍以上增高作为标准，可能取代睾丸活检判断精子发生障碍。②INH B在鉴别梗阻性与非梗阻性无精子症方面具有重要的参考价值。INH B可作为NOA患者睾丸晚期精子细胞抽吸(TESE)的预测指标。Ron Eckardstein 等报道，以睾丸活检形态学为金标准，发现血清INH B作为预测精子发生状态的指数比血清FSH更具敏感性。③测定血清INH B水平可作为早期诊断POF的一项重要指标。卵巢早衰(POF)患者卵巢储备降低，表现为卵巢内卵泡数和卵子质量均下降。由于INH B能够比基础FSH(bFSH)值更早、更直接反映卵巢储备，当INH B水平不足以维持 bFSH在正常范围时，在表现为血液bFSH的升高。因此测定血清INH B水平可作为早期诊断POF的一项重要指标。④INHB可以对IVF前卵巢反应进行判定。已有实验表明：在月经周期第3天外源性FSH卵巢刺激实验中发现，卵巢储备功能正常女性INHB 水平在实验前后24h的差值明显高于卵巢反应差的妇女。在IVF-ET治疗中发现，月经周期第3天INH B较低者，其促卵所需FSH用量大，对E2的反应性低、获卵数少，临床妊娠率低，周期取消率高，与第3天正常者相比，各项值有显著差异。并且第3天INH B的下降要早于FSH的上升。⑤INH B不仅能评估卵巢储备能力进而对辅助生殖治疗的预后进行预测，而且对有效控制超促排卵用药具有指导作用。国内已有研究发现nFSH 超排卵治疗第3天时，如INH B>40pg/mL，86％的患者可完成取卵，而INH B<40pg/mL，仅70％患者完成取卵泡。

由于INH B在人类的健康领域起着重要的作用，使得科学家们和医学工作者们不得不寻找可靠的方法来检测人体样本中INH B的水平，来为医学诊断与用药提供可靠的指导意见。临床上检测血清或精浆中INH B的方法有放射免疫分析(RIA)法和酶联免疫吸附法(双抗体夹心ELISA法)。由于RIA法不能区分INH A与INH B以及无活性的抑制素，因此实验结果无从分析。ELISA法使用一对高度特异的抗体，仅与有功能的INH B分子特异性结合。其检测原理是用微孔包被的βB亚单位的单克隆抗体捕获抗原，再与检测抗体(与酶耦联的α亚单位的特异性单克隆抗体)结合并显色；虽然与INH A会有0.5％的交叉反应，其特异性与敏感性基本能够满足科研和临床检测需要。

但是目前国外文献报道的血清INH B实验室正常参考值各家不一，集中在176.8～ 238ng/L区间，但与一些病理情况重叠，可能与受试者睾丸体积、测试样本量、FSH的波动及肥胖等有关，这使得科学工作者们无法确定一个统一的标准来给出确定性的意见对于哪些样本是正常的哪些样本是超出正常值域的。还有就是，在正常成年男性血清和精浆中可检出INH B，但不能在尿液中检出，表明目前市面上最通用的双抗体夹心ELISA 法的检测灵敏度还不够高，无法检测一些样本获取度难的患者。由于目前使用的检测方法是双抗体夹心ELISA法，检测过程中需要抗体抗原的孵育，洗脱，测吸光度等步骤，使得检测步骤繁琐费时(大于2小时)，费用昂贵以及无法多样本高通量检测。