[发明专利]利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗中黑盲蝽新种质的方法

说明书

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗中黑盲蝽新种质的方法。本发明以AsFAR基因的保守序列作为靶序列构建了RNAi载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将所述的AsFAR基因成功导入棉花宿主，得到了表达AsFAR基因双链RNA的转基因棉花。将该转基因棉花种植于室外网室中，通过接虫试验，表明转基因棉花可以导致中黑盲蝽AsFAR基因的表达量下调,进而影响其生殖能力，导致中黑盲蝽种群数量减少，从而达到抗虫的效果。本发明的转基因棉花对中黑盲蝽具有抵抗能力。本发明的转基因棉花可以与BT棉杂交生产多抗虫棉花新种质。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗中黑盲蝽新种质的方法。本发明提供了一种表达中黑盲蝽AsFAR基因双链RNA的转基因棉花的育种方法，为中黑盲蝽的防治提供一种新的策略。

背景技术

棉花是一种重要的经济作物，在棉花生产过程中虫害一直是棉花产量降低的主要原因之一。近年来，在农作物种植结构改变、BT棉的广泛种植、广谱杀虫剂的使用量大大减少等因素的综合影响下，使棉花的次要害虫——盲蝽蟓泛滥成灾，上升为主要害虫(Wu etal,2008)。盲蝽主要选择生长幼嫩的部位取食，棉苗期主要危害顶心或嫩头，造成死苗和无头苗，营养生长时期危害嫩叶形成破叶疯。棉花蕾铃期是其主要危害时期，受害的幼蕾，幼铃大部分脱落，未脱落的受害铃铃壳上留有黑褐色的刺孔，最后形成黑斑，受害铃壳内部常长有突起，引起棉铃畸形或不能正常开裂吐絮，从而影响棉花的品质和产量。目前在我国BT棉区盲蝽为害十分猖獗，因此急需探索出防治盲蝽的新手段和抵抗盲蝽的棉花新种质。

植物介导的RNAi是通过转基因技术得到表达昆虫关键基因双链RNA的植株，并通过自然取食将昆虫关键基因的双链RNA导入昆虫体内，从而引发昆虫体内相应基因的RNAi效应。2007年该技术成功应用于棉铃虫的防治(Mao et al.2007)，随后该技术快速发展并在抗虫中呈现出潜在的应用价值。2014年表达烟粉虱关键基因双连RNA的转基因烟草问世大大提高了其对烟粉虱的抗性。2015年田更等成功的创造了表达棉铃HMGR基因双连RNA的转基因棉花，接虫实验证明该棉花严重的影响了棉铃虫的生长和羽化(Tian et al,2015)。这些研究成果表明与目前可用的农药和BT毒蛋白相比，植物介导的RNAi技术是一种更加安全、特异、高效的植物保护新策略。

Fatty acyl-CoA reductases(FARs)属于NAD(P)H依赖型氧化还原酶，催化脂酰辅酶A转化为脂肪醇，并在多种生物中发挥着重要的生物学作用。例如FARs涉及微生物的能量储存储备,参与植物和鸟类表面蜡酯的生物合成。在大多数飞蛾和膜翅目昆虫中，FARs是生物性信息素合成过程中的关键酶。由于中黑盲蝽的性信息素的化学结构了飞蛾类似，所以华中农业大学马伟华老师课题组选择了在雌性中黑盲蝽后胸腺体中高量表达的Fattyacyl-CoA reductases(FARs)基因作为生物性信息素合成的候选基因，并命名为AsFAR.(Zhang et al,2014)在随后的预实验中发现沉默AsFAR基因对中黑盲蝽的性信息素产生没有影响，而是严重的抑制了其卵巢的发育，所以被认为该基因可能影响中黑盲蝽的生殖能力。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种构建表达中黑盲蝽AsFAR基因双链RNA的转基因棉花的方法，创造一种中黑盲蝽防治的棉花新种质，并为中黑盲蝽的防治提供一种新策略。

申请人构建了AsFAR基因的RNAi载体并通过农杆菌介导的遗传转化方法将其成功转入棉花受体，得到了表达AsFAR基因双链RNAi的转基因棉花。通过田间接虫实验证明该转基因棉花对中黑盲蝽具有显著的抵抗能力。

本发明的技术方案如下所述：