[发明专利]肉蛋白多肽标志物用于牛肉的掺伪鉴别方法

说明书

技术领域

本发明涉及肉类防掺伪，特别是一种肉蛋白多肽标志物用于牛肉的掺伪鉴别方法。

背景技术

牛肉是人们喜欢的食品，而且资源有限，但由于受宗教信仰、营养需求等多种因素的影响，牛肉中不允许掺假，但事实并非如此，由于受利益驱动，市场上时有牛肉掺假的现象，以牟取非法的利益，那么如何解决牛肉中掺假成份的鉴定已成为食品安全面临的焦点问题；目前，检测手段主要有依靠感官、ELISA和PCR等方法，感官法受主观因素影响结果可靠性差；ELISA技术不能用于加工食品的掺伪鉴别，且由于抗体不具有物种特异性、无法对混合肉的种源进行辨别，需要其他手段辅助检测；PCR技术可能会出假阳性或假阴性结果且无法准确定量掺假含量。因此如何解决牛肉中掺假防伪是需要认真解决的技术问题。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种肉蛋白多肽标志物用于牛肉的掺伪鉴别方法，可有效解决牛肉中掺假，以保证牛肉的纯质量问题。

本发明解决的技术方案是，包括以下步骤：

(1)、制备动物生肉、熟肉、肉制品：

所述的动物为牛、马、猪、兔、鸡、鸭；

(2)动物肉的预处理：

生肉和熟肉不做预处理，肉制品用乙醇、乙醚进行洗涤预处理；

(3)、掺假牛肉的制备：

A、非标混合肉的制作：所述的非标准肉是猪肉、马肉、兔肉、鸡肉或鸭肉，将非标准肉捣碎混合均匀，得非标混合肉；

B、制作不同掺假非标混合肉的牛肉：将标准牛肉(纯牛肉)与非标混合肉按不同质量百分比混合均匀，制成不同比例的掺假牛肉；

(4)、BCA法测定蛋白含量：方法是，分别称取生肉、熟肉、预处理后的肉制品作为样品，分别加入蛋白提取液，混悬后冰浴，离心，孵育，取出冷却至室温，测定吸光度值；

(5)、肉蛋白的酶切：分别称取生肉、熟肉、预处理后的肉制品作样品，分别加入蛋白提取液，匀浆，冰上孵育，重复3次；在冰上静置后加入预冷的丙酮，震荡摇匀，静置，再离心，弃上清液，用丙酮重悬后再次离心，弃掉上清，剩余固体用丙酮洗涤，将固体残渣挥去溶剂；然后用尿素/碳酸氢铵溶液重新溶解固体，加入DTT储备液反应，然后加入IAA储备液避光反应；加入碳酸氢铵溶液，计算肉蛋白浓度，加入Trypsin，酶切过夜，取出，加入甲酸终止反应，得动物肉多肽溶液；

(6)、净化除盐：HLB柱依次用甲醇、水活化，将动物肉多肽溶液离心，分别取上清液上载至HLB柱中，待样液全部流出后用水淋洗，使柱体保持抽干，再用甲醇洗脱，将收集的洗脱液于氮气流下浓缩至干，加入乙腈-甲酸溶解残渣，涡旋混匀，超声，过滤净化除盐；

(7)、上液相色谱-四级杆串联质谱测定动物肉中特征多肽：方法是，净化除盐后的动物肉多肽溶液上液相色谱-四级杆串联质谱测定，在高分辨质谱扫描、Maxquant、Sieve数据分析的基础上得到的特征多肽信息，LC-MS/MS方法首先在子离子扫描模式下，以HPLC-Q/Exactive中筛选出带2个或3个的电荷离子为母离子进行全扫描，获得特征子离子，以特征子离子对作为肉蛋白多肽标志物进行定性与定量分析，从而实现牛肉掺伪鉴别。

本发明方法新颖独特，操作使用方便，准确率高，有效解决肉类中的掺假问题，是肉类掺假鉴定上的创新，经济和社会效益显著。

具体实施方式

以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中，包括以下步骤：

(1)、肉类的制备：

所述的肉类为牛肉、马肉、猪肉、兔肉、鸡肉、鸭肉，其中：

生鲜肉：将市场购得的生鲜肉切成小块置于-80℃冰箱中冷冻；

熟肉：将生鲜肉在190℃加热1h，成熟肉，真空至干；

肉制品：煎炸肉：将生鲜肉放入高温植物油油中煎炸5min，取出后冷却至室温；腌肉：将生鲜肉加入氯化钠腌制24h，取出后用清水清洗，真空至干；肉肠：将生鲜肉中按常规方法加入辣椒面、花椒粉、白酒，装肠；肉泥：将生鲜肉加入20％氯化钠，4℃腌制4天，加水放置加热板上加热搅拌20min，再于高压蒸锅121℃蒸制15min；

(2)动物肉的预处理：

生肉和熟肉不做预处理，肉制品每2g用体积浓度95％乙醇洗2次，每次20mL，再用乙醚洗2次，每次10mL，然后将溶剂蒸发干，置于-80℃冰箱中；

(3)制备掺假牛肉：