[发明专利]一种用于生产哌啶甲酸的重组质粒、基因工程菌株及方法

权利要求书

1.一种产L-哌啶甲酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是过表达L-赖氨酸-α-氧化酶，葡萄糖脱氢酶，Pip2C还原酶和赖氨酸转运蛋白酶的宿主工程菌；所述宿主工程菌的赖氨酸降解途径中的必须基因cadA基因被敲除或敲减；所述基因工程菌为大肠杆菌；所述基因工程菌转化重组表达载体；所述重组表达载体包含L-赖氨酸-α-氧化酶基因LysoX，葡萄糖脱氢酶基因gcd，Pip2C还原酶基因DpkA和赖氨酸转运蛋白酶基因lysQ，并且所述四种酶基因序列与用于基因表达的启动子和终止序列可操作地连接；所述L-赖氨酸-α-氧化酶基因来自绿色木霉(Trichodermaviride)，葡萄糖脱氢酶基因来自大肠杆菌(Escherichia coli)K12-MG1655，Pip2C还原酶基因来自恶臭假单胞菌，赖氨酸转运蛋白酶基因来自乳酸球菌(Lactococcuslactissubsp)；所述酶基因LysoX、DpkA、LysQ根据宿主菌偏爱密码子进行密码子优化；所述重组表达载体使用如序列SEQ ID:48-53对四种酶基因的启动子和RBS序列进行同源重组和替换；所述重组表达载体对调控所述酶基因表达的RBS进行优化，以增强所述四种酶基因的表达。

2.一种L-哌啶甲酸的生产方法，其特征在于：将权利要求1所述的产L-哌啶甲酸的基因工程菌，按1～10％接种于5L发酵罐中，以葡萄糖或L-赖氨酸盐酸盐或L-赖氨酸为底物，先有氧积累菌体量，再微氧进行发酵的双阶段培养方式发酵。

3.如权利要求2所述的L-哌啶甲酸的生产方法，其特征在于：所述双阶段的第一阶段有氧积累菌体量：将种子液按1～20％接种发酵液中，发酵8h～15h后，以1～5g/L/h的流速添加葡萄糖或L-赖氨酸或L-赖氨酸盐酸盐；

第二阶段微氧发酵生产L-哌啶甲酸：待OD达到最大值后，降低转速和减小通气量，使罐内处于微氧或无氧状态，发酵过程中检测葡萄糖浓度低至10g/L时，补加葡萄糖使其浓度保持10g/L。

4.如权利要求2所述的L-哌啶甲酸的生产方法，其特征在于：种子培养基为LB培养基，发酵培养基为加葡萄糖的无机盐培养基，初始葡萄糖浓度为40g/L，另加无机盐K₂HPO₄·3H₂O 7.5g/L，MgSO₄·7H₂O₂g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.6g/L，柠檬酸2g/L，MnSO₄·H₂O 0.0045g/L，FeSO₄·7H₂O 0.0756g/L，Na₂SO₄ 0.02g/L，Zn₂SO₄ 0.0064g/L，CoCl₂·6H₂O 0.004g/L，CuSO₄·5H₂O 0.0006g/L。