[发明专利]一种盐辅助-液液萃取分离中药在离体肠道菌中有效成分的方法

说明书

本发明公开了一种盐辅助‑液液萃取分离中药在离体肠道菌中有效成分的方法，属于生物检测技术领域。肠道菌群对中药有效成分的代谢是中药发挥疗效的一大重要环节。然而，由于中药化学成分复杂，肠道菌群培养液基质干扰大，使中药有效成分和肠道菌群相互作用的研究遇到了瓶颈。本发明通过盐辅助‑液液萃取技术分离中药在肠道菌群培养基中的目标化合物，其特征是向肠道菌群培养液中加入亲水性有机溶剂和适量可溶性无机盐或有机盐，混匀后静置分层。上层为富含目标化合物的有机溶剂层，下层为肠道菌群培养液层。该方法能有效降低生物基质及中药中其他非目标化合物的干扰，操作简便，成本低，为研究中药有效成分在肠道菌群中的代谢奠定了方法学基础。

技术领域

本发明涉及一种盐辅助-液液萃取分离中药在离体肠道菌中有效成分的方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

已有几千年历史的中药，其疗效已获得临床的广泛认可。中药大多数以口服为主，进入胃肠道后能够与肠道菌群相互作用。经肠道菌群代谢后，有效成分才能被吸收，从而发挥其药理作用。肠道菌群对中药的代谢已引起了全世界的广泛关注，因其直接影响了中药的疗效和中药在体内的吸收和代谢过程。然而，中药成分复杂，且肠道菌培养基的基质背景干扰大，成为了肠道菌对中药代谢研究的一大瓶颈。因此肠道菌对中药代谢的研究迫切需要一种方法，该方法能够在混合的复杂基质中选择性地分离出目标化合物。

目前，生物样本的前处理方法包括液液萃取，蛋白沉淀和固相萃取等技术，这些传统的方法具有萃取效率低，有机溶剂用量大，干扰大，选择性低，成本高和操作繁琐等缺点，尤其在中药和肠道菌培养液两大复杂基质的混合体系中分离出目标化合物，并非理想手段。寻找一种能够消除干扰，效率高，成本低，操作简便的方法，将有助于解决在研究中药化学成分和肠道菌群相互作用过程中所遇到的问题。

盐辅助-液液萃取法是加入一种或几种无机盐利用相转变分离现象，使原本均相的混合溶液分层，同时萃取出目标分析物的新型液液萃取法。盐辅助-液液萃取法可弥补传统液液萃取法对亲水性目标物萃取效率低的缺点，且不易产生乳化现象，所需有机溶剂用量小；较传统蛋白沉淀法，能更有选择性地分离出目标化合物，降低基质干扰；与固相萃取比较，盐辅助-液液萃取法成本低，操作简便，耗时短。近年来，类似的盐析方法的应用对于人和动物血浆中代谢物的分析，显示了提取效率高，无內源性成分干扰等优点，而基于盐辅助-液液萃取技术的中药在肠道菌中有效成分的分离，尚未见有文献报道。

发明内容

本发明的目的在于克服传统生物样本前处理方法的不足，提供一个通过盐辅助-液液萃取技术分离中药在离体肠道菌群中目标化合物的方法。

本发明的技术方案：

离体肠道菌群是人或动物的粪便置于厌氧菌液体培养基中孵育一定时间后的菌群。向肠道菌群液中加入中药提取物，再次孵育一定时间后，加入与肠道菌反应体系互溶的亲水性有机溶剂停止反应，并加入适量可溶性无机盐或有机盐，混匀后于室温下静置，使其分层；上层为富含目标化合物的有机溶剂层，下层为肠道菌群培养液层，底部为析出的固体无机盐。

所述可溶性无机盐或有机盐可以为氯化钠、甲酸铵、柠檬酸钠、乙酸铵、硫酸钠、硫酸镁、硫酸锌、氯化镁、氯化钾、碳酸钾、硫酸铵或氯化铵等。

所述亲水性有机溶剂可以为乙腈、异丙醇、甲醇、乙醇、丙酮、二甲亚砜或乙腈-水饱和正丁醇混合有机溶剂等。

本发明可直接用于处理肠道菌群培养液，使其终止反应，在萃取分离目标化合物的同时去除肠道菌液中的菌体和蛋白。在样品前处理技术方面，与传统的液液萃取和蛋白沉淀法比较，盐辅助-液液萃取法能防止乳化现象的发生，有效地分离大分子物质，避免生物基质和中药中其他非目标化合物的干扰，且提取效率高，所需有机溶剂用量小，是更为环保和理想的生物样品前处理技术。与固相萃取技术相比较，盐辅助-液液萃取法操作更为简单快捷，耗时短，成本小，更经济实用。