[发明专利]从胎盘中富集血小板和提取活性因子的方法

说明书

本发明涉及从胎盘中富集血小板和提取活性因子的方法。具体地说，从胎盘中富集血小板和提取活性因子的方法，其包括以下步骤：(1)血小板富集；(2)血小板裂解物制备，根据血小板浓度将步骤(1)富集的血小板样本稀释；化学裂解：按照沉淀体积：激活剂＝1：5‑10进行血小板激活；室温静止，进行离心，分别收集上清液和沉淀，上清液至4摄氏度冰箱保存；物理裂解：将上一步骤收集的沉淀进行37摄氏度/‑80摄氏度反复冻融三次裂解，得裂解物；将上面步骤收集的上清液和裂解后产物充分混匀得裂解物；(3)血小板源性活性因子冻干与保存。还涉及一种冻干粉。本发明方法具有如本发明说明书所述有益效果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及从胎盘中富集血小板和提取活性因子的方法，特别是涉及从来源于自体的胎盘中富集血小板和提取活性因子的方法。本发明制得的活性因子可以直接涂抹受损皮肤表面或微针注射，用于创伤愈合。

背景技术

近年来，随着对间充质干细胞研究的不断深入，其分泌因子已成为研究者们的热点。间充质干细胞可以分泌多种具有生物活性的细胞因子，这些细胞因子可有效地调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞。

针对目前的干细胞分选技术，比较常见是的磁珠分选，但常规的分选中，磁珠会随同干细胞一同进行后续的培养，即磁珠并没有从干细胞上脱离下来，这样对于干细胞的后期生产，必定会产生一定的影响，虽然有一些方法，如加入一些菌或者其他物质进行降解，但这样也相当于加入了其他的外源蛋白质等成分，造成对干细胞的二次污染，所以实际上并没有解决上述问题。

目前也有一些对干细胞培养上清液进行提取纯化的报道，但效果依然不佳，例如公告号为CN102600057B的专利公开了一种人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，对得到的细胞培养液采用单一的3000D滤膜进行超滤截留，其去掉了部分杂质，但是糖类等杂质仍未除掉，并且还导致细胞因子大量损失。

本领域仍然期待有新的方法获得细胞活性因子，例如期待有新的方法从胎盘中富集血小板和提取活性因子。

发明内容

本发明目的在于提供一种以有效的性能来从胎盘中富集血小板和提取活性因子的方法。已经出人意料的发现，使用本发明方法可以实现本发明一个或多个方面的有益效果并制取活性因子。本发明基于此发现而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了一种从胎盘中富集血小板和提取活性因子的方法，其包括以下步骤：

(1)血小板富集

11)将胎盘放入无菌托盘中，弃除血污块；

12)用无菌的剪刀将胎盘剪碎，并用0.9％氯化钠生理盐水进行组织表面和内部冲洗，挤压收集胎盘血后，弃除组织；

13)将上一步骤收集的胎盘血经无菌的300目滤网过滤，混匀后取样进行血常规检测；

14)将上一步骤经过滤的胎盘血收集至250ml离心瓶中，500-2000g，10-15min离心，收集上清；

15)将上一步骤收集的上清转移至新的50ml离心管中，2400-5000g，10-20min离心后，收集沉淀，弃上清；

16)将上一步骤收集的沉淀进行重悬，得到血小板样本，取样进行血常规检测(主要用于富集后血小板含量检测，一般富集后血小板浓度是富集前的15-80倍，即富集系数为15-80倍，示例性的结果见表1)；

(2)血小板裂解物制备

21)根据血小板浓度将步骤(1)富集的血小板样本稀释2-20倍；

22)化学裂解：按照沉淀体积：激活剂(例如，其中含有氯化钙、葡萄糖酸钙或凝血酶)＝1：5-10进行血小板激活；