[发明专利]一种用于MDBK细胞的无血清冻存培养基

说明书

技术领域

本发明属于细胞及生物工程技术领域，涉及一种用于MDBK细胞的无血清冻存培养基。

背景技术

细胞培养技术广泛用于生命科学研究的研究，在实验中有必要对细胞株进行的冷冻保存留种及方便后续不同时间实验的进行。连续细胞株的冻存可减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变以及避免有限细胞系出现衰老或恶性转化。一般是用甘油或二甲基亚砜(DMSO)以及血清添加在基础培养基中来冻存细胞，这些添加剂能保护细胞抵抗细胞内冰晶和渗透效应引起的冷冻损伤。冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质，一般可分为渗透性与非渗透性两类。一般非渗透性保护剂是大分子聚合物，不能渗透到细胞内部，通过稀释胞外电解质的浓度，减少溶质损伤和结合水分子，降低胞外自由水的含量，减少冰晶损伤。常用的有：蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、聚乙二醇 (PEG)、葡聚糖 (dextran)、白蛋白 (albumin)及羟乙基淀粉 (HES) 等。而渗透性保护剂则主要为小分子物质，多易溶于水，与水分子结合的能力强，易穿透细胞膜进入细胞内部，在细胞内能降低细胞的冰点；并提高细胞膜对水的通透性，减少冰晶形成；复苏时促进细胞外水分进入细胞，缓解渗透性肿胀引起的损伤；稀释未结冰溶液中电解质的浓度，减少溶质损伤。主要有以下几种：甘油、二甲基亚砜 (DMSO)、丙二醇、乙二醇等。

目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要是采用添加适量保护剂缓慢冷冻法来冻存细胞，如果细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水份会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应，如：细胞脱水使局部电解质浓度增高、导致pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，从而引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易被破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，这样可以最大限度的保存细胞活力。在现有技术中冻存细胞均使用血清与DMSO混合的方法，因动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致；取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠性，且血清成本高昂。

1957年2月18日，S.H. Madin和N.B. Darby从一只表观正常的成年牛肾脏建立了MDBK细胞株。通常MDBK细胞是以贴壁方式生长的上皮样细胞。目前，MDBK 细胞系广泛用于多种牛源病毒的增殖和纯化，如：牛副流感病毒3型 (Bovine parainfluenza virus type3, BPIV3) ，牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus ,BVDV），牛疱疹病毒1型(Bovine herpesvirus 1, BoHV-1)，牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV) 等。现有的针对MDBK细胞的冻存方案常采用10％DMSO及20~50％FBS的冻存方案去保存MDBK细胞，该方案能够很好的为细胞提供营养物质，该含血清细胞冻存方案其细胞回收率约可达到85~90％，细胞活率约可达到93~95％左右。细胞经短时间冻存再复苏后仍能维持较高的活率。但是，在细胞培养及冻存中使用的胎牛血清或小牛血清可导致一些问题，尤其是MDBK细胞作为牛源细胞系，广泛应用于牛源病毒的研究及疫苗制备等研究，其对牛血清内存在的病毒敏感，应用于细胞培养及冻存的血清质量易对其造成影响。而且近年来，针对于包括MDBK细胞在内的许多动物细胞系的低血清、无血清培养基及该种培养方式的研究已经成为热点，促使我们需要开发无血清冻存的方式来维持这种无血清培养模式。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于MDBK细胞的无血清冻存培养基，用于解决目前在冻存MDBK细胞时，需要添加胎牛血清或小牛血清，容易引入牛源病毒的问题。

本发明通过以下技术方案来实现：一种用于MDBK细胞的无血清冻存培养基，包含的组分及体积百分比浓度为：9～11%的二甲基亚砜、1～3％的右旋糖酐40溶液，余量为DMEM高糖培养基，其中，所述的右旋糖酐40溶液为质量百分比浓度为10%的右旋糖酐40的DMEM高糖培养基溶液。本发明对所述DMEM高糖培养基的来源没有特殊的限制，具体的，可采用Gibco公司提供的规格为500mL/瓶的DMEN高糖培养基，该培养基为常规的市售产品。