[发明专利]一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1细胞载体的制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含5～10％新生牛血清和1000～2000单位/mL青链霉素双抗的DMEM培养液在37℃、5％CO2的条件下培养2～3天，接着用无血清DMEM培养液清洗细胞2～3次，得细胞载体；

S2病毒的接种：将禽流感病毒H9亚型和禽腺病毒4型的病毒液分别按终体积1:50～1:500接种到步骤S1得到的细胞载体中，放置37℃条件下吸附30～60min后吸弃病毒液，接着加入培养基A，于37℃、5％CO2的条件下培养48～72h，出现80％细胞病变，得病变细胞；

S3病毒液收集：将步骤S2得到的病变细胞冻融2～3次，于4℃、5000rpm的条件下离心8～12min，分别收集禽流感病毒H9亚型上清液和禽腺病毒4型上清液，接着进行TCID50和EID50检测，合格后，将上述上清液分别超滤浓缩，得禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型病毒液；

S4病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活步骤S3得到的禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型病毒液，得禽流感病毒H9亚型疫苗抗原和禽腺病毒4型毒疫苗抗原；

S5疫苗配制：

a油相制备：取92～96份白油，1～3份硬脂酸铝，3～5份司盘-80，将白油加热到75～85℃，接着加入司盘-80和硬脂酸铝，搅拌溶解至透明，灭菌，得油相；

b水相制备：取40～50份步骤S4得到的禽流感病毒H9亚型疫苗抗原，40～50份步骤S4得到的禽腺病毒4型毒疫苗抗原，加入3～5份吐温-80，搅拌至完全溶解，得水相；

c乳化：将步骤a得到的油相与步骤b得到的水相混合，在14000～16000rpm的条件下乳化4-6min，按照每瓶250mL进行分装，即得；

所述步骤S2中的培养基A包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：

谷氨酰胺2mmol/L、重组人胰岛素6μg/mL、人血清白蛋白2mg/mL、转铁蛋白4μg/mL、生物素3μg/mL和生长因子14mmol/L；

所述生长因子由焦磷酸硫胺素和天麻素按质量比5:2组成。

2.如权利要求1所述的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1细胞载体的制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含8％新生牛血清和15000单位/mL青链霉素双抗的DMEM培养液在37℃、5％CO2的条件下培养2天，接着用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，得细胞载体；

S2病毒的接种：将禽流感病毒H9亚型和禽腺病毒4型的病毒液分别按终体积1:100接种到步骤S1得到的细胞载体中，放置37℃条件下吸附30～60min后吸弃病毒液，接着加入培养基A，于37℃、5％CO2的条件下培养56h，出现80％细胞病变，得病变细胞；

S3病毒液收集：将步骤S2得到的病变细胞冻融3次，于4℃、5000rpm离心条件下10min后，分别收集禽流感病毒H9亚型上清液和禽腺病毒4型上清液，接着进行TCID50和EID50检测，合格后，将上述上清液分别超滤浓缩，得禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型毒病毒液；

S4病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活步骤S3得到的禽流感病毒H9亚型病毒液和禽腺病毒4型毒病毒液，得禽流感病毒H9亚型疫苗抗原和禽腺病毒4型毒疫苗抗原；

a油相制备：取94份白油，2份硬脂酸铝，4份司盘-80，将白油加热到78℃，接着加入司盘-80和硬脂酸铝，搅拌溶解至透明，灭菌，得油相；

b水相制备：取48份步骤S4得到的禽流感病毒H9亚型疫苗抗原，48份步骤S4得到的禽腺病毒4型毒疫苗抗原，加入4份吐温-80，搅拌至完全溶解，得水相；

c乳化：将步骤a得到的油相与步骤b得到的水相混合，在15000rpm的条件下乳化5min，按照每瓶250mL进行分装，即得。

3.如权利要求1或2所述的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的LMH细胞放置转瓶内培养。

4.如权利要求1或2所述的禽流感病毒、禽腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的LMH细胞放置微载体反应器内培养，微载体使用量为2～10g/L。