[发明专利]电学监测纳米限域空间内酶催化动力学的装置及方法

说明书

技术领域

本发明属于一种定量检测纳米限域空间内酶活性的生物传感技术，具体涉及一种电学监测纳米限域空间内酶催化动力学的装置及方法，利用纳米孔道阵列监测酶在纳米限域空间内催化沉积。

背景技术

酶是广泛存在生物体内的活性物质，具有催化效率高、选择性强、反应条件温和等优点，广泛应用于合成、催化、燃料电池等领域。多年来，水溶性酶的结构、稳定性和催化能力是通过溶解在一定成分浓度和温度缓冲水溶液中来分析它们的结构，研究它们的催化活性。从这个角度来说，某种经纯化可溶性酶的体外特性可以用来阐述酶催化特定化学反应能力及反应机制。然而，简单缓冲溶液并不能反映酶催化通常发生在成分复杂的生物介质环境。大多数生物体内酶催化反应发生在分子拥挤的环境中或在限域空间内，如在表面上，嵌入表面，或在体积小内。因此，体内感兴趣的酶在被综合模拟时这些因素是需要被考虑的。传统的酶活性检测是在体外缓冲溶液中进行，无法反应酶在体内空间受限情况的催化性能。离子通道又称为膜蛋白，嵌入细胞膜在生命活动中扮演至关重要的角色。受到蛋白质通道的启发，固态纳米通道相比生物纳米通道具有良好的机械强度，通道大小可调，容易进行功能修饰的优点，近年来引起越来越多的研究兴趣。在固态纳米通道内检测酶的活性可以很好地模拟酶在限域空间内的催化性能。目前现有的固态纳米通道内检测酶活性的研究方法主要是基于荧光和电化学检测方法。

现有技术有的在检测端粒酶活性过程中，在钾离子存在形成G-四联体，对通过纳米孔道的指示分子产生的电化学信号进行检测。还有的在检测疾病相关的脂肪酸分子和醛类分子采用电化学阻抗信号变化。这些检测方法都仅对反应前后两种状态的信号进行检测，无法对酶催化反应的整个过程进行监测，不能得到酶催化动力学参数。这些检测方法无法收集游离产物的实时信号，其检测过程也会受到扩散和传质影响，导致信号收集效率低。因此，结合纳米通道阵列和酶催化沉积的优势发展对酶催化过程进行简单、灵敏地分析监测，实现对酶动力学过程进行分析具有重要的意义，为开发更为灵敏的检测手段提供理论依据。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种电学监测纳米限域空间内酶催化动力学的装置及方法。本发明中针对酶催化生成聚合物，聚合物在纳米通道中沉积从而使通道的有效孔径减小，通过适时测定通道离子电流信号来监测酶催化过程，根据得到的电流-时间信号，计算出酶催化动力学参数。

本发明的目的是通过以下的技术方案来实现的：

一、一种电学监测纳米限域空间内酶催化动力学的装置：

包括检测池腔体和检测电极，检测池腔体分为进样池腔体和渗透池腔体，进样池腔体和渗透池腔体之间通过打孔石英片连接，所述的石英片设有中心通孔，中心通孔处安装修饰酶的多孔阳极氧化铝圆片，进样池腔体和渗透池腔体的腔体上端设有检测电极，检测电极下端插入到进样池腔体和渗透池腔体中。

所述的修饰酶的多孔阳极氧化铝圆片通过环氧树脂胶固定粘接在中心通孔的一侧所述的孔端面，使得阳极氧化铝圆片的中心和中心通孔的中心重合。

所述的石英片尺寸为20mm*20mm*0.5mm，中心通孔为直径0.2mm～3mm的圆孔。

所述的检测电极采用双Ag/AgCl饱和KCl溶液电极。

所述检测电极连接到电化学工作站。

二、一种电学监测纳米限域空间内酶催化动力学的方法，包括以下步骤：

(1)在多孔阳极氧化铝(Anodic aluminum oxide，AAO)纳米孔阵列的孔壁上修饰酶；

(2)将修饰酶的多孔阳极氧化铝纳米孔阵列固定于打孔石英片的中心通孔，将打孔石英片置于进样池和渗透池之间，制作形成检测池；

进样池和渗透池中均加入PBS溶液。

(3)向进样池中加入反应底物，触发多孔阳极氧化铝纳米孔阵列上的修饰酶发送催化反应，并在中心通孔的多孔阳极氧化铝纳米孔阵列的纳米孔道中生成聚合物，形成沉淀；

(4)利用电学方法对通过多孔阳极氧化铝纳米孔阵列的纳米孔道的通道电流进行实时监测，间隔采集到不同时刻的电流数据；

(5)根据采集到的电流-时间数据拟合绘制电流-时间关系曲线，作出Lineweaver-Burk图，根据Lineweaver-Burk图计算得到酶动力学参数。

所述的酶动力学参数包括米氏常数(K_M)和最大反应速度(V_max)。