[发明专利]构巢曲霉异源表达系统的构建及其应用

说明书

本发明涉及一种构巢曲霉异源表达系统的构建方法，包括如下步骤(1)或步骤(2)：(1)敲除构巢曲霉dppV基因、mnn9基因或pepA基因中的任一或任两个，构建蛋白水解酶敲除的构巢曲霉突变菌株；(2)在构巢曲霉中过表达RsmA基因，构建RsmA基因过表达的构巢曲霉突变菌株。本发明所提供的构巢曲霉蛋白水解酶敲除和RsmA过表达菌株有助于重要工业蛋白酶的高效表达生产；所提供的gpdA启动子和xylP启动子表达元件可调控在构巢曲霉异源表达真菌天然产物时的产生不同化合物生成的方向，也可以用于改造或发现可用于医药的化合物，对于研发具有重要工业价值的蛋白酶和潜在的真菌天然产物药物具有重要的意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及构巢曲霉异源表达系统的构建及其应用。

背景技术

丝状真菌具有表达量大、胞外分泌率高、蛋白质分子折叠和修饰系统接近高等真核细胞、生产的外源蛋白具有天然活性等特性，因此，在饮料、奶酪等食品工业和酶的商业化生产中得到广泛使用，成为非常具吸引力的可用于生产异源重组蛋白的表达宿主系统。在基础研究上，蛋白表达系统的建立是从分子水平上研究该菌株中酶表达调控的先决条件，同时，又是研究酶的结构功能关系，以定向改造酶的结构，达到改进酶催化活性和催化特性的重要基础；在应用研究上，因多拷贝整合是丝状真菌转化的特点，因此，通过转化引入多拷贝内源基因后，利用菌株中现成的酶形成机制，可较大幅度地提高酶产量。丝状真菌在发酵工业上长期以来一直用于抗生素、酶类和有机酸等的生产，丝状真菌强大的分泌酶类的能力使其在工业酶生产中确立了核心地位。丝状真菌作为基因工程受体菌有着与细菌、酵母菌不同的独特优势，主要包括：(1)具有很高的蛋白产生和分泌能力；(2)能正确进行各种翻译后加工，包括肽链剪切、糖基化和形成二硫键等修饰；(3)多种丝状真菌是确认的安全生产菌株，并有成熟的发酵和后处理工艺；(4)可以获得稳定的重组子，进而可以进行可控性育种，是很有希望的异源基因表达系统，利用丝状真菌转化引起多拷贝整合的特点为丝状真菌工业用菌株的育种开辟了新的途径。这些广泛具有工业应用价值的丝状真菌主要包括Aspergillus等属的一些类群，如A.awamori、A.niger、A.oryzae、A.nidulans和Trichoderma reesei等。为了充分挖掘丝状真菌作为细胞工厂生产异源蛋白的能力，研究主要集中在胞内蛋白质量控制的细胞机制、分泌途径改造、蛋白修饰加工及工程菌稳定性等方面。近年来，组学实验技术的迅速发展为实现丝状真菌高效表达异源蛋白提供了更为广阔的前景，如何利用新方法新技术构建新的高效丝状真菌表达系统来生产重要的酶类越来越迫切。就构巢曲霉而言，其DNA转化早在上世纪80年代就已取得成功，构巢曲霉(A.nidulans)作为丝状真菌研究的模式菌株基因组测序工作早已完成，近年来，构巢曲霉的转化系统也得到很大的发展，丝状真菌构巢曲霉作为重要的一种异源蛋白表达的宿主菌是提高外源蛋白表达效率的重要选择之一。

漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，主要由真菌产生。漆酶催化氧化呈现高度的底物非专一性，对许多结构不同、难降解的高分子有机物质具有广谱的降解能力。据统计，漆酶可催化包括酚类及其衍生物、氯酚及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等六大结构类型的多达250多种底物的氧化。在适宜的氧化还原介质存在的情况下，漆酶还可以氧化非酚的木质素亚基等物质；漆酶能把分子氧直接还原为水，漆酶的氧化过程不需要过氧化氢的参与和其它次级代谢产物的存在,即可催化有机污染物的氧化，与物理的和化学的方法相比，漆酶作为绿色环保型生物催化剂具有高效率、低能耗的优点，其应用涉及造纸、纺织、木材加工、饮料食品、土壤修复和生物能源等多个领域。正是漆酶广泛而重要的应用前景，引起了生物科学、环境科学及多种工业部门的特别关注，成为世界范围的研究热点，如何获得大量廉价的漆酶显得日益重要。由于自然界中野生型菌株产生漆酶与其次生代谢相关，产生的漆酶活力普遍比较低，远远达不到生产和研究的需要；其次，漆酶生产菌株的发酵水平普遍较低，很难满足对漆酶的需要。