[发明专利]一种靶向筛选外源基因双整合位点提高人C5单抗表达产量的方法

说明书

本发明提供了一种以靶向筛选外源基因双整合位点提高人C5单抗表达产量的方法，包括：(1)将人补体C5抗体的轻、重链编码基因分别插入两个真核表达载体；(2)获得重组轻、重链编码质粒并共转染至中国仓鼠(CHO)DG44细胞；(3)用FISH技术筛选轻、重链编码基因双整合定位在染色体1q1和1q13的细胞克隆。本发明筛选获得的1q1和1q13区支持轻、重链编码基因的强转录，可实现人C5单克隆抗体在CHO‑DG44细胞中的高效和稳定表达，其产物可用于治疗因C5水平升高而受累的各种疾病。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向筛选双整合位点提高人补体C5单克隆抗体表达产量的方法。

背景技术

人C5单克隆抗体(“Soliris”，也称为依库株单抗)先后被批准用于“阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)”和“非典型溶血尿毒综合征(aHUs)”。其它适应症如“难治性重症肌无力”已完成临床试验，“复发性视神经脊髓炎谱系疾病”和“抗体介导的排斥反应”也已进入临床试验的后期阶段。依库珠单抗是目前全球最昂贵的药物，除了因治疗疾病的特殊定价外，早期生物技术和重组蛋白表达体系制约了抗体的表达产量，也是导致该药成本偏高的重要因素。中国目前尚无生产依库株单抗的企业，进口药的昂贵价格尚不能满足中国患者逐年增加的临床需求，同时也需要低成本药物的生产方法。

宿主细胞自身遗传稳定性，如宿主染色体或基因组变异(位置效应)是导致重组蛋白表达差异变化的重要原因。表达治疗性重组蛋白的生产用细胞系大多为CHO细胞及其亚型，包括CHO-K1、CHO-S和DG44等，这些细胞有共同的遗传特征，即染色体非整倍性，大约为18-21条染色体，且只有1号染色体保留了成对性和正常基因组，其余染色体则因频繁的重排致基因组变异或丢失，直接影响其转录活性。外源基因通常是随机整合至宿主染色体，通过非靶向性筛选获得的表达体系其产量低，持续表达的稳定性也较差。研究发现，外源基因整合在大的染色体较整合至小染色体具有产物表达优势。应用CHO-DUK细胞表达人促红细胞生成素(Epo)的研究发现，Epo编码基因在大染色体(包括1和2号染色体)上整合表现出高产蛋白特征，而在其它染色体，尤其小染色体上整合则引起重组蛋白表达不稳定或低产量表达(Lattenmayer等,Cytotechnology.2006；51:171–182)。我们最近用染色体荧光原位杂交(FISH)技术发现，外源基因在1号染色体1q12-13位点整合的CHO-S细胞系，其表达重组蛋白的产量明显高于整合于其它染色体位点的细胞系，且持续表达也十分稳定(Li等,PLoS One.2016；11:e0163893)。由此提示：CHO细胞及其亚型细胞的大染色体尤其整合至1号染色体，可能是外源基因整合的最佳靶位点。

发明内容

本发明的目的在于克服外源基因随机整合的不足，提供一种靶向筛选双整合位点在DG44细胞染色体1q1和1q13区域的抗体轻、重链编码基因，进而提高人补体C5单克隆抗体表达产量的方法。

一种靶向筛选双整合位点在染色体1q1和1q13区域的抗体轻、重链编码基因，进而提高人补体C5单克隆抗体表达产量的方法，其包括如下步骤：

(1)将人C5单克隆抗体的轻、重链编码基因分别插入包含“UCOE”的两个真核表达载体的多克隆位点，获得重组表达质粒；

(2)将步骤(1)获得的重组表达质粒共转染至CHO-DG44细胞，经MTX浓度梯度加压筛选，获得表达C5单克隆抗体的重组细胞群；

(3)将重组细胞群以500细胞/ml接种于半固体培养基(6孔培养板)，待细胞逐渐长至肉眼可见的集落时(大约2周)，挑取单集落细胞至96孔板培养，之后逐渐转移至48孔板、24孔板和6孔板培养；

(4)单集落细胞按照步骤(4)进行第二轮筛选，挑取单克隆细胞，经扩大培养后，常规制备染色体；