[发明专利]一种同时检测鲇形目鱼类四种致病菌的多重PCR引物组及监测方法

权利要求书

1.一种同时检测鲇形目鱼类四种致病菌的多重PCR引物组，其特征在于，所述多重PCR引物组包括鲇爱德华氏菌引物对、柱状黄杆菌引物对、嗜水气单孢菌引物对和点状气单胞菌引物对，

所述鲇爱德华氏菌引物对的核酸序列为：

EI-F1：5’-CGGCAGGTCATATCAAAGAG-3’，

EI-R1：5’-CGATAATGTGGTAATGCGGT-3’，

所述柱状黄杆菌引物对的核酸序列为：

FC-F2：5’-ATCCAGAACGTGTGATAGGT-3’，

FC-R2：5’-AAGTTCCAGCTACGATACCA-3’，

所述嗜水气单孢菌引物对的核酸序列为：

AH-F3：5’-AGTTTGTCGCCAATATCCGC-3’，

AH-R3：5’-CTCGTACGCTCATGAGGACT-3’，

所述点状气单胞菌引物对的核酸序列为：

AP-F4：5’-CAGCTACCCCTCGACTATGG-3’，

AP-R4：5’-TGCGGATCTTGTGACTGACT-3’。

2.一种同时检测鲇形目鱼类四种致病菌的PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）、制备DNA模板：利用DNA试剂盒抽提基因组DNA作为模板；

2）、多重PCR扩增：利用权利要求1中的多重PCR引物组对DNA模板进行多重PCR扩增；

3）、检测：对步骤2）中得到的扩增产物作为样品进行凝胶电泳检测，利用TAE缓冲液配置1.2%的琼脂糖凝胶，点样后，电压设置为100~140伏，电泳20~40分钟；

若有1170bp的条带说明样品中有鲇爱德华氏菌，若有895bp的条带说明样品中有柱状黄杆菌，若有554bp的条带说明样品中有嗜水气单孢菌，若有418bp的条带说明样品中有点状气单胞菌；

上述方法用于非疾病诊断目的的检测。

3.根据权利要求2所述一种同时检测鲇形目鱼类四种致病菌的PCR检测方法，其特征在于，所述步骤2）中的多重PCR扩增的反应体系为：

2×mix 23～27uL，

10umol/L EI-F1 l~2uL，

10umol/L EI-R1 l~2uL，

10umol/L FC-F2 l~2uL，

10umol/L FC-R2 l~2uL，

10umol/L AH-F3 l~2uL，

10umol/L AH-R3 l~2uL，

10umol/L AP-F4 l~2uL，

10umol/L AP-R4 l~2uL，

DNA模板 l~2uL，

ddH₂O 加至50uL，

所述的2×mix包含Phusion DNA Polymerase、2×Phusion PCR Buffer、3mM MgC1₂和400uM dNTP。

4.根据权利要求2所述一种同时检测鲇形目鱼类四种致病菌的PCR检测方法，其特征在于，所述步骤2）中的多重PCR扩增的扩增条件为：98℃预变性3~5min，98℃变性30~45s，57~60℃退火25~35s，72℃延伸50~60s，进行28-32个循环后，然后再72℃延伸7~10 min，完成PCR扩增，扩增产物4℃保存。