[发明专利]CK-MB融合蛋白及其制备方法和检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种CK‑MB融合蛋白及其制备方法和检测试剂盒，该融合蛋白由CK‑M蛋白和CK‑B蛋白通过Loop连接形成，与天然CK‑MB蛋白功能相同。其制备方法是将人源性CK‑M和CK‑B的编码基因序列用Loop的核苷酸碱基偶联在一起，克隆到表达载体得到表达质粒，转化到大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，培养产物经过细菌超声波破壁，离心取上清，依次过镍柱、强阴离子交换柱Q柱和Superdex G200分子筛层析柱，得到活性蛋白含量高达85％的高纯度蛋白。本发明采用稀土荧光微球作为标记载体制备了测CK‑MB的试剂盒，具有稳定、敏感、定量、简便、快速、结果可靠的特点。

技术领域

本发明涉及CK-MB融合蛋白及其制备方法和检测试剂盒。具体是一种新型肌酸激酶MB型(CK-MB)标准品的基因工程表达及其时间分辨荧光定量检测试剂盒。

背景技术

肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。肌酸激酶有四种同功酶形式：肌肉型(MM)、脑型(BB)、杂化型(MB)和线粒体型(MiMi)。MM型主要存在于各种肌肉细胞中，BB型主要存在于脑细胞中，MB型主要存在于心肌细胞中，MiMi型主要存在于心肌和骨骼肌线粒体中。肌肉型肌酸激酶分子是由两个相同的亚基组成的二聚体。

CK-MB在临床诊断中有十分重要的意义，在各种病变包括肌肉萎缩和心肌梗塞发生时，人的血清中CK-MB水平迅速提高，目前认为在心肌梗塞的诊断中测定CK-MB的活性比做心电图更为可靠。心肌梗塞时，肌酸激酶在起病6小时内升高，24小时达高峰，3～4日内恢复正常。且CK-MB诊断的特异性最高。CK-MB因其具有重要的生理功能和临床应用价值已引起人们广泛的重视和深入的研究。

现阶段，临床上CK-MB的检测方法有双抗夹心免疫化学发光法、放射性免疫法、酶联免疫法(ELISA)、免疫层析法等。

双抗夹心免疫化学发光法具有敏感度高、所需时间短等优点，但是不能检测正常人血中的CK-MB。

放射性免疫法是通过将放射活性分子共价交联至CK-MB抗体免疫反应后测定放射活性分子的放射信号来间接定量检测CK-MB的一种超微量分析方法。具有特异性好、灵敏度高(可达ng和pg级)、操作简便、样品制备简单、精确定量等优点，但是该方法中操作人员会接触到放射性物质，可能会损害操作人员的身体，而且检测完成后怎样处置放射性材料也是个严重的问题。

CK-MB的酶联免疫检测方法是双抗夹心ELISA方法，将一对CK-MB单抗分别进行酶标板固化和酶标记，抗原抗体反应后，通过酶与底物的呈色反应，即可显示特定抗原是否存在，并可根据呈色之深浅进行定量分析。具有特异性强、灵敏度高、操作简便、快速、样品能量大、不但能进行定性检测也能定量检测，但是耗时较长。

侧向层析法在疾病快速诊断、小分子快速检测等领域已得到了广泛的应用。其原理是将特异性的抗原或抗体包被到硝酸纤维素膜上，构成检测线，将二抗包被在距离检测线在2～3毫米的区域构成质控线。当样本中的目标分子与带有特定标记物的检测抗体结合后，从硝酸纤维素膜的上样端向吸水端层析。由于毛细管作用，复合物将沿着膜向前移动，但移动到检测线时，样品中的目标分子将被检测线中的捕获抗体捕捉而停留在检测线，多余的检测抗体则通过检测线后被质控线的二抗所捕捉。常用的标记物为胶体金颗粒、荧光微球等。

CK-MB的胶体金免疫层析法通过静电吸附将CK-MB抗体标记到胶体金颗粒表面，通过观察胶体金颗粒在检测线上的聚集显色判断检测结果。具有快速、简便、直观等优点，但同时存在着依靠肉眼识别、灵敏度低、无法精确定量、标记通过静电吸附，标记产物不稳定等缺点。