[发明专利]一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体的讲是一种高亲和力的人源化抗CD20单克隆抗体。

背景技术

非霍奇金淋巴(non-Hodgkin lymphoma，NHL)是临床中常见的淋巴造血系统恶性肿瘤，非霍奇金淋巴瘤是一种常见的B细胞型淋巴瘤。随着NHL发病的逐年增加，化疗药物是治疗NHL的最主要的方式。虽然，放化疗药物对有效控制患者病情、延长缓解期具有重要意义。然而，在对患者进行放化疗时，不但可以杀伤肿瘤细胞，同时也会对人体内的正常细胞产生一定的杀伤作用，继而不同程度的影响患者消化功能、骨髓功能，同时还会产生血小板及白细胞减少、掉发脱发、胃口缺乏、恶心呕吐等一系列的不良反应，致使患者的生活质量水平降低、甚至有的患者因为不能忍受化疗带来的痛苦而停止进行化疗。现代医疗技术中的放化疗技术已经不能满足人类迫切治疗该类疾病的渴求，而具有靶向治疗机制的单克隆抗体方法开始被人们广泛研究和应用。近几年，对NHL的靶向性治疗以及单克隆抗体药物的临床研究取得了较大的突破，可以被人们接受使用的便是抗CD20单克隆抗体药物，并且它的临床治疗效果得到了广泛的认可。CD20分子在B淋巴细胞表面特异性表达，是分子量大小为34-36kDa的膜蛋白，由297个氨基酸组成，在细胞表面以非糖基化的形式呈现。CD20分子包含4个跨膜区，其中羧基端与氨基端都在胞质内侧，而第三跨膜区与第四跨膜区间的含有43个氨基酸的环区，构成了CD20分子的抗原表位。临床NHL 85％为B细胞型淋巴瘤，CD20分子在大多数成熟和恶性B细胞表面表达。并且CD20分子对抗体来说容易接近，结合后不易脱落，不会发生抗原的调变,成为治疗NHL的理想靶点。

抗体的人源化有两大原则：设计高亲和力的抗体；降低抗体的免疫原性。目前，对CD20抗体进行人源化与亲和力的提高都是分别进行的。

在抗体亲和力改造方面，通常只是提高抗体的亲和力，仍含有鼠源序列的框架区，如：2014年，郝庆钦(非专利文献1)等，以人cTnI作为抗原，免疫小鼠，通过杂交瘤技术制备了高亲和力的抗人cTnI单抗；2016年，李若彤(非专利文:2)先构建大鼠抗小鼠CD40单链抗体的噬菌体展示文库并对文库进行不断的筛选得到高亲和力的抗体。赵磊(非专利文献3)(上海抗体药物国家工程研究中心--专利CN102030826A(专利文献1))在前期得到的Rituximab/CD20抗原肽共结晶的基础上，通过基于抗体进化规律的计算机辅助设计，将重链可变区57位天冬氨酸和102位酪氨酸分别突变成谷氨酸和赖氨酸，轻链可变区93位的天冬酰胺突变成精氨酸，这样改造所获得的新抗体比Rituximab的亲和力高了15.47倍。虽然同时对这三点进行突变所得到的抗体的亲和力得到了极大地提高了，但由于其整个可变区都是异源的，在进行临床试用时仍能够被人体的免疫系统识别而产生HAMA反应，因此有必要对鼠单抗可变区作进一步的人源化改造。

而在降低抗体免疫原性方面，通常是将含有鼠源序列的骨架替换成人的骨架，如：2014年，贾茹(非专利文献4)等利用计算机在蛋白质结构数据库中找到与rituximab空间结构最相近的人IgG1为骨架，将其互补决定区(CDR)进行移植，从而得到人源化的CD20抗体。2017年，Zhang YF(非专利文献5)等构建人源化兔单克隆抗体时将含盖大多数抗原接触残基的组合Kabat/IMGT/Paratome的CDR区移植到人种系构架序列中。张海峰(非专利文献6)(永卓博济生物医药有限公司--专利US 20130089540A1(专利文献2))就采用独特的抗体人源化技术，以鼠单抗2B8(Rituximab的原始鼠源单抗)为基础，选择与MHC II结合位点较少的人胚系抗体框架序列，极大的降低了抗体的免疫原性。通过该方法对CD20抗体进行的人源化，其免疫原性具有极大的降低。

由以上可以看出，前人在对抗体改造时，只对其中一方面进行改造，还没有发现将这两者同时进行设计与改造，获得既有低免疫原性又有高亲和力的抗体药物。如将两者同时进行改造，则杀伤肿瘤细胞的效果有可能比只是改造其中一方面的效果要好。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：郝庆,钦周,建平,等.一对高亲和力抗人肌钙蛋白I单克隆抗体的制备及鉴定[J].2014，21(4):462-465.

非专利文献2：刘若彤.抗小鼠CD40单链抗体噬菌体展示文库的构建及高亲和力抗体的筛选[D].天津:天津医科大学,2016.

非专利文献3：赵磊.新型CD20抗体的设计及生物学功能研究[D],上海:第二军医大学,2011.