[发明专利]几丁质结合蛋白Bt‑CBP及其编码基因和制备方法与应用

权利要求书

1.一种几丁质结合蛋白Bt-CBP，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的几丁质结合蛋白Bt-CBP，其特征在于所述的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示，由463个氨基酸组成。

3.一种如权利要求1所述的几丁质结合蛋白Bt-CBP的制备方法,其特征在于,

(1)DNA序列扩增：以苏云金芽胞杆菌ATCC-35866菌株基因组为模板,以Up1和Dn1为上、下游引物，用高保真TransStartFastPfu DNAPolymeras进行PCR扩增；所述上游引物Up1如SEQ IDNo.3所示，下游引物Dn1，如SEQ IDNo.4所示；所得扩增片段的序列如No.5所示；

(2)一步法构建大肠杆菌表达质粒：使用全式金的无缝连接试剂盒，将所得扩增片段与NcoI和XhoI酶切后的pET28a(+)线性片段，按5:1的比例混合于PCR管中，50℃反应15～30min，之后将重组产物直接用于转化大肠杆菌DH5ɑ，通过菌落PCR、酶切筛选鉴定阳性转化子克隆,得到重组表达质粒pET28(+)Bt-CBP；

(3)构建大肠杆菌重组表达菌株：将重组表达质粒pET28(+)Bt-CBP转化至大肠杆菌BL21,挑选阳性转化子克隆,得到重组表达菌株E.coli Bt-CBP；

(4)几丁质结合蛋白Bt-CBP的诱导表达：将重组表达菌株E.coli Bt-CBP接入含30μg/ml卡那霉素的LB培养基中,于37℃过夜培养活化后,然后按1％的接种量接种到含卡那霉素的LB培养基中,当OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导剂,在25℃，180rpm条件下诱导培养8-12h；

(5)几丁质结合蛋白Bt-CBP的纯化：将步骤(4)经诱导的菌液移入干净的离心管中，4℃，离心收集菌体,用缓冲液洗涤菌体,再用缓冲液重悬菌体之后置于冰上超声破碎，破碎后的样品于4℃下离心，收集上清即为粗蛋白；粗蛋白用镍柱进行亲和层析纯化,得到几丁质结合蛋白。

4.一种如权利要求1所述的几丁质结合蛋白Bt-CBP在增强几丁质酶酶活性中的应用。

5.一种如权利要求1所述的几丁质结合蛋白Bt-CBP在防治真菌病害中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用是几丁质结合蛋白Bt-CBP单独或与几丁质酶联合使用。

7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于所述的真菌病害为黄瓜灰霉病菌或尖孢镰刀菌病害。