[发明专利]克隆目标DNA片段的方法及载体

权利要求书

1.一种从生物体内克隆目标DNA片段到载体上的方法，包括如下步骤：

(1)识别位于所述目标DNA片段一侧的CRISPR-Cas9识别位点，所述CRISPR-Cas9识别位点为23nt的序列，包含20nt的spacer序列以及位于所述spacer序列3’端的3nt的PAM序列；

(2)识别分别位于所述目标DNA片段两侧的整合位点和第一重组位点，其中，所述第一重组位点位于所述目标DNA片段与所述CRISPR-Cas9识别位点的之间；

(3)将所述整合位点、所述CRISPR-Cas9识别位点以及所述第一重组位点克隆到所述载体中，其中，所述CRISPR-Cas9识别位点在所述载体上的位置位于所述整合位点和所述第一重组位点之间，且所述CRISPR-Cas9识别位点的一端连接所述整合位点，另一端连接所述第一重组位点，其中，所述载体具有Cas9的编码序列、sgRNA序列以及第一抗性基因的编码序列，其中所述Cas9编码序列是诱导型表达，所述第一抗性基因的编码序列和所述sgRNA序列是组成型表达；

(4)将所述spacer序列克隆到所述载体上sgRNA序列的5’端；

(5)所述载体上的整合位点在所述生物体内与所述目标DNA片段一侧的整合位点发生同源重组，从而将所述载体整合到所述目标DNA片段所在的遗传物质上，然后通过所述第一抗性基因筛选发生载体整合的阳性克隆；

(6)诱导所述阳性克隆的Cas9编码序列的表达，切割分别位于所述目标DNA片段两侧的两个CRISPR-Cas9识别位点，然后分别位于CRISPR-Cas9系统切割产生的同一个DNA片段两端的两个所述第一重组位点之间发生同源重组，生成包含所述目标DNA片段的质粒；

(7)提取所述质粒，通过所述第一抗性基因筛选获得携带所述目标DNA片段的质粒。

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括：

识别位于所述目标DNA片段一侧的第二重组位点，其中，所述CRISPR-Cas9识别位点位于所述第一重组位点位于和所述第二重组位点之间；并且

在步骤(3)中将所述第二重组位点也整合到所述载体中，其中所述第二重组位点在所述载体上位于所述整合位点和所述CRISPR-Cas9识别位点之间，且所述整合位点、所述第二重组位点、所述CRISPR-Cas9识别位点和所述第一重组位点依次连接；

在步骤(6)中，位于所述CRISPR-Cas9系统切割产生的片段末端的两个所述第二重组位点之间发生同源重组。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述载体包括pMB1、p15A、pSC101复制子的任一种或多种，以及一种或多种限制性内切酶的单一酶切位点。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述载体为SG5复制子被删除的pCRISPR-Cas9载体，并且步骤(5)和步骤(7)中用安普霉素进行筛选，步骤(6)中用硫链丝菌素诱导所述Cas9编码序列的表达。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述目标DNA片段包括大片段的调控序列、含有大片段内含子和调控序列的基因、或者由功能相关基因构成的基因簇。

6.根据权利要求2所述的方法，其中，所述整合位点的长度为2～3kb，所述第一重组位点和所述第二重组位点的长度为300～700bp。