[发明专利]用于检测II型糖尿病易感基因CREB1单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法及应用

说明书

本发明公开了一种用于检测II型糖尿病易感基因CREB1单核苷酸多态性的PCR‑RFLP方法及应用，首先，根据DNA池测序结果，检测到的基因多态性包括：CREB1基因启动子区距转录起始点‑1354位T或G的单核苷酸多态性和‑1343位T或A的单核苷酸多态性。以待测样本基因组DNA为模板，以引物对P为引物，在Taq DNA聚合酶、Buffer（缓冲环境）、Mg＋＋、dNTPs存在的情况下，PCR扩增包含多态位点的CREB1基因序列，然后将PCR产物一分为二，分别用Hha I和Xsp I限制性内切酶进行消化，酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳分型。此外，将这两个多态位点与II型糖尿病的临床指标关联分析，结果显示不同基因型与空腹血糖和糖化血红蛋白水平显著相关。

技术领域

本发明涉及人类疾病分子生物学检测领域，具体涉及一种用于检测II型糖尿病易感基因CREB1单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法及其应用。

背景技术

糖尿病被认为是世界上第五大严重危害人类健康的疾病，其中90%为非胰岛素依赖型糖尿病，又称为II型糖尿病。该病属于复杂的代谢紊乱性疾病，其发病机制复杂，是遗传和环境互作的结果，其中遗传多态性可能是影响个体间疾病易感性的主要因素。由于II型糖尿病的早期临床症状不明显，往往使患者延误最佳的治疗时机。因此，寻找和鉴定出人类基因组中与II型糖尿病相关的遗传标记，将有利于该疾病的早期筛查和诊断，及时控制病程的进展。

遗传标记主要分为两类：Ⅰ类是间接反映DNA水平遗传变异的表观标记，如形态标记、细胞标记和生化标记；Ⅱ类是直接反映DNA水平遗传变异的分子标记。分子标记是遗传标记的重要组成部分，能够反映DNA水平的各种遗传变异，包括点突变、缺失、插入、易位、倒位、重排或存在长短与重排不一的重复多态性。总之，分子标记在生命科学领域中已经被广泛应用，在遗传标记中占主导地位。

基于分子标记而发展起来的诊断技术能够准确地检测出与人类复杂疾病相关的变异位点，是疾病早期筛查和诊断的有效方法。应用分子标记诊断首先是在DNA水平上检测与疾病临床检测指标密切相关的遗传标记，其次是建立该遗传多态性的快速检测方法，最终实现分子标记检测方法在疾病早期诊断和易感人群筛查中的应用。

单核苷酸多态性（SNP）是分子标记的重要组成部分，在基因组中广泛分布。限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）是一种检测SNP的有效技术，根据SNP位点附近的序列信息，如果没有自然酶切位点，通过PCR引入特定的限制性内切酶位点并进行切割，然后进行琼脂糖或聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点的不同基因型。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且对所检测的序列位点无特殊性要求。

环磷腺苷效应元件结合蛋白1（CREB1）是含有亮氨酸拉链结构域的一种重要的转录因子。细胞内的cAMP水平升高能够激活CREB1，进而调控含CREs元件的下游基因。研究表明，CREB1还可以通过募集共刺激分子（如PGC-1）调控下游基因的表达，参与血糖和胰高血糖素的代谢过程。Herzig S等研究发现，敲除CREB1基因的小鼠表现出脂肪肝表型，且降低胰岛素的敏感性（Herzig S, Hedrick S, Morantte I, Koo S-H, Galimi F, Montminy M (2003) CREB controls hepatic lipid metabolism through nuclear hormone receptor PPAR-[gamma]. Nature 426:190–193）。由此可见，CREB1基因与糖尿病的发生密切相关。