[发明专利]一种肿瘤组织的保存方法及保存试剂

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及一种肿瘤组织的保存方法及保存试剂。

背景技术

随着肿瘤对人类的影响和危害性的增加，如何保护、保存并充分利用人类肿瘤遗传资源，提高我国肿瘤防治水平，已经成为当务之急。作为肿瘤研究材料的活肿瘤组织标本在促进肿瘤研究进展过程中扮演了重要角色，具有重要的科研和临床应用价值，而活肿瘤组织保存技术成为实现这些价值的基础。

目前活肿瘤组织保存的方式一般为直接冷冻保存，所需冷冻保护剂多采用DMSO、血清和细胞培养液组成，需要现用现配，且这种组织冻存液的稳定性较差，使得其保质期较短，保存条件也较为苛刻。

使用现有的冷冻保存方法在冻存及解冻后无法保证肿瘤组织的结构完整性，且极易丢失肿瘤自身的遗传特性，降低了组织标本的临床研究价值。

目前急需一种更加长效且更加便捷的肿瘤组织保存方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种肿瘤组织的保存方法及保存试剂。

本发明所提供的肿瘤组织保存方法，具体可包括如下步骤：

(1)将待保存的肿瘤组织置于肿瘤组织酶解试剂中，于20-25℃培养10-20min(如15min)，得到酶解后肿瘤组织；

所述肿瘤组织酶解试剂中含有透明质酸酶和DNA酶Ⅰ；每升所述肿瘤组织酶解试剂中含有40-150U的所述透明质酸酶，含有高于40Kunitz U的所述DNA酶Ⅰ。

其中，所述透明质酸酶的酶活定义同sigma公司货号为H3506的透明质酸酶的酶活定义。所述DNA酶Ⅰ的酶活定义同sigma公司货号为DN25-1G的DNA酶Ⅰ的酶活定义。

在本发明中，所述透明质酸酶具体为sigma公司产品，货号为H3506。所述DNA酶Ⅰ具体为sigma公司产品，货号为DN25-1G。相应的，所述透明质酸酶在所述肿瘤组织酶解试剂中的浓度可为100-150mg/mL；所述DNA酶Ⅰ在所述肿瘤组织酶解试剂中的浓度可为100-120mg/mL。

(2)将所述酶解后肿瘤组织置于冷冻保存液中，在4℃预平衡10-20min(如15min)，得到预平衡后肿瘤组织；

(3)将所述预平衡后肿瘤组织进行程序化冷冻，待温度降至-150℃后，转入液氮罐中进行储存。

鉴于多数实体肿瘤组织含有大量的胶原结缔组织，使其本身具备结构致密的特性，因而本发明通过既定的肿瘤组织酶解试剂对其进行室温培养的操作，实现了肿瘤组织酶解试剂对胶原等组织进行酶解的效果，使致密的实体肿瘤组织间质疏松，进而利于后续预平衡过程中冷冻保存液的顺利渗透；进而缩短了后续在冷冻保存液中的平衡时间。通过酶解处理之后，在预平衡的过程中，仅用10-20分钟即可达到预平衡效果(冷冻保存液渗透到肿瘤组织中心)；与现有技术中常见的30-90分钟的预平衡时间相比，大幅缩短了预平衡的时间，避免了由于预平衡时间过长，进而导致其冷冻保护剂对肿瘤组织的细胞毒性损伤。

在所述方法中，所述肿瘤组织酶解试剂由所述透明质酸酶、所述DNA酶Ⅰ和含体积百分含量为10％胎牛血清的DMEM培养液组成。

更加具体的，每升所述肿瘤组织酶解试剂中含有48-120U的所述透明质酸酶，含有高于40Kunitz U的所述DNA酶Ⅰ，余量为含体积百分含量为10％胎牛血清的DMEM培养液。其中，所述透明质酸酶的酶活定义同sigma公司货号为H3506的透明质酸酶的酶活定义。所述DNA酶Ⅰ的酶活定义同sigma公司货号为DN25-1G的DNA酶Ⅰ的酶活定义。在本发明中，所述透明质酸酶具体为sigma公司产品，货号为H3506。所述DNA酶Ⅰ具体为sigma公司产品，货号为DN25-1G。相应的，所述透明质酸酶在所述肿瘤组织酶解试剂中的浓度具体为120mg/mL；所述DNA酶Ⅰ在所述肿瘤组织酶解试剂中的浓度具体为100mg/mL。

所述冷冻保存液由DMSO与蔗糖组成；在所述冷冻保存液中，DMSO与蔗糖的浓度分别为1mol/L和0.1mol/L。

步骤(1)中，在将所述待保存的肿瘤组织置于所述肿瘤组织酶解试剂中之前，还可包括如下步骤：收集肿瘤组织，置于含体积百分含量为10％胎牛血清的DMEM培养液中，在5-10min内用冰盒运送至生物安全柜内，更换新鲜的含体积百分含量为10％胎牛血清的DMEM培养液，并将肿瘤组织剪切成(0.5mm-1.5mm)×(0.8mm-1.2mm)×(2.5mm-3.5mm)大小，得到所述待保存的肿瘤组织。