[发明专利]骨髓间充质干细胞来源的外分泌体的应用及其试验方法

说明书

技术领域

本发明涉及生命科学领域，具体涉及一种骨髓瘤病人骨髓间充质干细胞来源的外分泌体在提高骨髓瘤细胞药物敏感性中的应用，还涉及一种验证该种应用效果的试验方法。

背景技术

外分泌体（exosome）是由多种细胞分泌到细胞外的小囊泡，具有抗原呈递和诱导抗肿瘤免疫作用。长期以来，细胞来源的外分泌体被认为是无意义的细胞残核，但近年来的研究发现，它是促进细胞间信息交流的重要机制，能稳定存在于人体血液等多种体液中。

外分泌体最早是由Johnstone等人在研究网织红细胞向成熟红细胞转变过程中发现的。它是一种直径约30~100nm，密度介于1.13~1.21g/cm3、双凹圆盘状、外包双层脂质膜的囊泡。蛋白质占据了外分泌体的绝大部分内容物，包括参与其结构形成的蛋白质，如微管蛋白、肌动蛋白等细胞骨架成分，多分布于外分泌体的表面或内腔中；还有膜转运和融合相关蛋白，如Flotillin1、TSG101等以及四跨膜蛋白CD9、CD81。来源于外分泌体的miRNA在干细胞分化的调控、胚胎发育和器官发生、造血和肿瘤发生等生理和病理过程中起重要调节作用。

间充质干细胞来源的外分泌体包含MSC特异性的mRNA，如神经性的RAX2、成骨性的BMPl5、上皮性的CEACAM5以及造血性的EPX等。不同来源的外分泌体有其特异的蛋白和不同的行使功能的关键分子。例如源于网织红细胞的外泌体富含转铁蛋白受体，源于抗原提呈细胞的外泌体含有主要组织相容性复合体Ⅰ、Ⅱ类分子及其共刺激分子，肿瘤细胞自身分泌的外泌体表面富含主要组织相容性复合体分子、伴侣分子热休克蛋白和肿瘤相关抗原。

发明内容

本发明目的是提供一种骨髓瘤病人骨髓间充质干细胞来源的外分泌体的新应用，以提高骨髓瘤病人骨髓瘤细胞的药物敏感性，同时本发明还提供了一种测试髓瘤病人骨髓间充质干细胞来源的外分泌体对骨髓瘤细胞药物敏感性的试验方法。

本发明的技术方案是：一种骨髓间充质干细胞来源的外分泌体的应用，具体应用于提高骨髓瘤病人的骨髓瘤细胞的药物敏感性。

一种骨髓瘤病人骨髓间充质干细胞来源的外分泌体对骨髓瘤细胞药物敏感性影响的试验方法，包括以下步骤：

1）外分泌体的提取

一种可快速从细胞外液中提取外分泌体的方法，提取出的外分泌体量较大，可以保证无菌，且可以用于后续的生物活性实验。具体的步骤如下：

1.1）血清去除外分泌体：血清用超速离心机在4℃条件下，100000xg离心2h，去除沉淀，然后取上清用0.22μm滤膜过滤除菌，即可得到无菌的无外分泌体的血清，抽滤完成后于4℃保存备用；

1.2）细胞用含有10%无外分泌体血清的培养基培养，培养24~72h后可用于提取细胞分泌到细胞外液中的外分泌体；

1.3）16%PEG储存液的制备：称取5.944g氯化钠和16g PEG8000，溶解于100ml去离子水中，磁力搅拌器搅拌溶解完成后用0.22μm滤膜过滤除菌，即可得到无菌的16%PEG储存液，4℃保存备用；

1.4）取步骤1.2）中由含10%无外分泌体血清的培养基培养的细胞悬液于15ml离心管中，1000rpm离心5min，去除细胞；

1.5）然后转移步骤1.4）中15ml离心管内的上清于一支15ml离心管中，3000rpm~4000rpm离心30min，去除细胞碎屑及大的囊泡；

1.6）接着吸取步骤1.5）中15ml离心管内的上清于另一支15ml离心管中，加入等体积的16%PEG储存液，使得PEG的工作浓度达到8%，4℃过夜孵育，使其聚集沉降；

1.7）次日，将步骤1.6）中得到的细胞上清和PEG混合液于3000rpm~4000rpm条件下离心60min，离心完成后去上清，所得沉淀即为从细胞外液中所提取到的外分泌体。

2）外分泌体的定量

2.1）取步骤1.6）中得到的细胞上清和PEG混合液1ml，于3000rpm~4000rpm条件下离心60min，离心完成后去上清，所得沉淀即为从细胞外液中所提取到的外分泌体；

2.2）向步骤2.1）中提取到的外分泌体中加入100ul 1×细胞裂解液，超声波破碎仪破碎五次，使其充分裂解，然后用BCA蛋白定量法测定浓度，即可知道1ml细胞上清和PEG混合液中可提取的外分泌体的量；

2.3）根据比例，取不同体积同批次的细胞上清和PEG混合液于3000rpm~4000rpm条件下离心60min，即可得到不同量的外分泌体，用于后续的细胞活性实验。

3）外分泌体活性实验