[发明专利]荧光假单胞菌突变菌株的筛选方法及其在生物防治中的应用

说明书

本发明公开了荧光假单胞菌突变菌株Pf5‑NiF、Pf5‑△retS或Pf5‑△retS‑NiF，及其筛选方法和应用，利用Red/ET重组和直接克隆技术，将固氮斯氏假单胞菌DSM4166基因组中的NiF固氮基因岛整体克隆到荧光假单胞菌Pf5的基因组中，使之顺利异源表达，得到基因工程菌株Pf5‑NiF，从而使本身无生物固氮的荧光假单胞菌Pf5产生生物固氮功能；此外，基因定向无痕敲除荧光假单胞菌Pf5基因组中的retS基因，得到基因工程菌株Pf5‑△retS，提高了抗生素2，4‑二乙酰基藤黄酚和红色素的表达量，从而得到杀菌活性更强的荧光假单胞菌Pf5突变菌株。

技术领域

本发明涉及一种荧光假单胞菌突变菌株，具体涉及一种荧光假单胞菌突变菌株的筛选方法及其在生物防治中的应用。本发明属于生物技术领域。

背景技术

荧光假单胞菌(Pseudomonas protegens)属革兰氏阴性杆状细菌，常见于植物根围和土壤中，是作为植物根际促生细菌(plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)中研究较多的一种细菌，由于其繁殖速度快、适应能力强、易于人工培养、制剂稳定、施用方便、不污染环境、防治多种植物病害等优点，我国农业部已将其列为可注册登记的微生物农药和肥料品种之一，在全国范围内推广使用。由于其能产生一种或多种抗生素，如2，4-二乙酰基藤黄酚(2,4-diacetylphloroglu-cinol,2,4-DAPG)、藤黄绿脓菌素(pyoluteorin,Plt)、吩嗪 (phenazine)、硝吡咯菌素(pyrrolnitrin,Prn)、AprA蛋白酶和氢氰酸(HCN)等，所以对植物病害，尤其是土传病害如猝倒病、根腐病、枯萎病等均有很好的防治作用，是一类重要的有益微生物资源，在农业生产上具有非常重要的意义。但是，荧光假单胞菌本身并不具有生物固氮的功能。

固氮斯氏假单胞菌DSM4166(Pseudomonas stutzeri DSM4166)是一株分离自德国高粱根际土壤的联合固氮菌，已被保藏在德意志微生物保藏中心(Deutsche SammLung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)且分配有保藏号DSM4166。该菌在无氨和微好氧条件下可将空气中的氮气转化为植物可以直接利用的铵。目前该菌株的基因组测序工作已经完成，在基因组序列中发现了一段69kb大小的NiF固氮基因岛，包含有58个不同的基因。然而基因组测序结果表明该细菌的次级代谢产物不丰富，抑菌能力较弱。

Red/ET同源重组和直接克隆技术是一种基于噬菌体重组酶的新型遗传工程技术，它的基本原理是通过噬菌体重组酶介导大肠杆菌体内的同源重组，从而对DNA序列进行修饰的重组技术。该技术不受DNA分子大小和酶切位点的限制，能够精确、高效地对基因簇进行基因插入、基因敲除、点突变和模块替换等操作，只需用30-50bp大小的同源臂就能获得较高的重组效率。直接克隆技术则是利用RecET重组酶将天然产物基因簇直接从微生物基因组一步克隆到大肠杆菌表达载体上，只需3天就能完成整个基因簇的克隆，而且重组步骤在大肠杆菌细胞内发生，可以避免基因簇在克隆过程中发生突变。目前，该技术已经广泛应用于微生物天然产物基因簇的克隆和异源表达研究。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供荧光假单胞菌(Pseudomonasprotegens Pf5)突变菌株Pf5-NiF、Pf5-△retS或Pf5-△retS-NiF。

本发明还提供上述菌株的筛选方法及其在生物防治中的应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：