[发明专利]一种禽流感病毒纳米PCR检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及禽流感病毒纳米PCR检测试剂盒及其应用，本发明属于预防兽医学检验领域。

背景技术

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）是指感染并危害家禽的甲型流感病毒，在临床上因感染宿主种类、免疫状态、病毒毒力及环境因素等不同而表现为无症状带毒的隐性感染、亚临床症状、轻度呼吸系统症状、产蛋量下降或急性全身性高度致死性感染。据病毒对4-6周龄鸡致病性的不同可将禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）分为高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV）、低致病性禽流感病毒（Low pathogenic avian influenza virus，LPAIV）和无致病性禽流感病毒（Non-pathogenic avian influenza virus, NPAIV）。世界动物卫生组织已将高致病性禽流感归为必须报告的动物疫病，我国将其列入一类动物疫病。

禽流感病毒的检测方法主要包括传统的病原分离、聚合酶链式反应（PCR）、环介导等温扩增技术、琼脂扩散及胶体金免疫电镜技术等，这些方法在病原的鉴定及疫病的确诊中发挥了重要作用。PCR检测技术因其操作简单、灵敏性高、重复性好及等优点被广泛应用。但在实际应用中，该技术存在诸多局限性，例如PCR反应始终存在不同程度的非特异性扩增，尤其是复杂体系的扩增会出现非特异性产物扩增及扩增效率不够高等问题。为解决以上问题，寻找可以提高PCR特异性和效率的添加剂显得极为重要。

纳米PCR技术是一种新型的PCR技术，其原理是把直径为1 nm -100 nm的固相纳米金属颗粒悬浮在液体中形成纳米流体。由于纳米金颗粒具有良好的热传导性能，因此在添加了纳米金颗粒的PCR反应体系中，反应混合液会更快的达到目标温度，减少了整个体系达到温度平衡所用的时间，进而缩短在非目标温度的停留时间，降低了非特异性扩增，提高特异性扩增产量。因此，目前急需建立一种能够快速、特异的检测禽流感病毒的纳米PCR检测技术。

发明内容

本发明针对上述现有技术的不足，提供了一种用于禽流感病毒检测的纳米PCR试剂盒及其应用，该试剂盒能够快速、特异的检测禽流感病毒。

本发明所采用的技术方案是：

一种用于禽流感病毒检测的纳米PCR试剂盒，包括反转录酶、5×反转录缓冲液、RNA酶抑制剂、0.1M DTT、dNTPs混合液、反转录引物、2×NanoPCR Mix、上游引物和下游引物，其中，上游引物的序列为SEQ ID No.1所示，下游引物的序列为SEQ ID No.2所示。

引物是根据GenBank公布的所有亚型的禽流感病毒血凝素蛋白（HA）编码基因保守序列区域设计的一对特异性引物。

所述的2×NanoPCR Mix由DNA聚合酶、dNTPs混合液和2×NanoPCR缓冲液组成。

所述的反转录酶为M-MLV反转录酶。

所述的反转录引物的序列为SEQ ID No.3所示。

所述的试剂盒还包括RNA提取试剂：病毒灭活裂解液Trizol、三氯甲烷、异丙醇和75%乙醇。

所述的试剂盒还包括阳性对照。

其中，阳性对照可为禽流感病毒接种鸡胚后，48~96小时死亡鸡胚的尿囊液。

本发明还提出了所述的试剂盒在制备检测待检样品中是否含有禽流感病毒的产品中的应用。

应用所述试剂盒检测待检样品中是否含有禽流感病毒的方法，包括如下步骤：

1、待检样品的处理

待检样品为鸡、鸭、鹅等家禽的肝脏、胰腺、脾脏和脑组织或咽喉棉拭子等，其处理方法为：组织脏器等在生物安全柜内剪碎后与等渗磷酸盐缓冲液（0.01M PBS）按1:3~1:5的质量体积比混匀后进行研磨匀浆，6 000~8 000 rpm 离心5分钟，上清用于总RNA的提取。咽喉棉拭子等进行振荡混匀后，6 000~8 000 rpm 离心5分钟，获得的上清可用于提取RNA。

2、病毒RNA的提取

（1）取250μL经过预处理的待检样品加入750μL 病毒灭活裂解液Trizol中，充分混匀15 s，再加入200 μL预冷的三氯甲烷后，充分倒置混匀。

（2）室温静置10min后，于4℃12 000 rpm离心15 min，小心吸取600 μL上清液与等体积-20℃预冷的异丙醇。反复颠倒混匀后，于4℃下12 000 rpm离心15 min。