[发明专利]一种用于免疫活性肽免疫活性检测的荧光偏振分析方法

权利要求书

1.一种用于免疫活性肽免疫活性检测的荧光偏振方法，其特征在于包括如下步骤：

1)一个确定流感病毒荧光标记物工作浓度的步骤，用100mmol/L、pH5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液按5倍比例稀释流感病毒荧光标记物，取200μL于96孔板中，37℃孵育72h，用SpectraMax M5酶标仪在吸收波长为492nm，发射波长为520nm下检测荧光偏振光强度，以达到稳定偏振值所对应的最小浓度作为流感病毒荧光标记物的工作浓度；

2)一个确定HLA-DRB₄复合蛋白工作浓度的步骤，用100mmol/L、pH5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液按1:2、1:4、1:8、1:80和1:800的比例稀释HLA-DRB₄复合蛋白溶液；取100μL HLA-DRB₄复合蛋白溶液于96孔板，然后加入流感病毒荧光标记物和100mmol/L、pH5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，使流感病毒荧光标记物终浓度为步骤(1)确定的工作浓度，同时使得96孔板中的体积为200ul；将反应溶液混匀后于37℃孵育72min，用SpectraMax M5酶标仪在吸收波长为492nm、发射波长为520nm的条件下检测荧光偏振光强度，以最大偏振值60％对应的HLA-DRB₄复合蛋白浓度作为其最佳工作浓度；

3)一个建立免疫活性肽的结合率曲线的步骤，以流感病毒素浓度为横坐标，结合率为纵坐标建立免疫活性肽的结合率曲线，结合率的计算公式如下：

式中：FP_样品为待检测样品的荧光偏振值，FP_标记肽为流感病毒荧光标记物标记肽对应的荧光偏振值，FP_无竞争为流感病毒荧光标记物荧光标记肽和HLA-DRB₄复合蛋白的荧光偏振值；

4)一个制备免疫活性肽样品的步骤，称取200mgII型胶原蛋白，加双蒸水配置成1mg/mL的溶液，置于温度为50℃的酶反应器中，按加酶量为80U/ml加入中性蛋白酶酶解3h，蛋白酶的酶活为10000U/g，收集酶解液，将酶解液于40℃、100rpm的旋转蒸发仪中浓缩，使其终浓度为4mg/ml；

5)一个检测免疫活性肽免疫活性的步骤，将浓度为4mg/ml的免疫活性肽样品用双蒸水按100倍稀释倍数稀释成系列浓度，取总体积为200μL的溶液，该溶液中含有50μL的流感病毒荧光标记物、50μL的HLA-DRB4复合蛋白溶液以及100μL的免疫活性肽溶液，所述的流感病毒荧光标记物的浓度符合步骤1)的结果，所述的HLA-DRB4复合蛋白溶液的浓度符合步骤2)的结果，将该溶液置于96孔板中，混匀后37℃孵育72min，再用SpectraMax M5酶标仪在吸收波长为492nm、发射波长为520nm下检测其荧光偏振光强度，然后计算免疫活性肽IC50值，其中，IC50值定义为在竞争性试验中结合率为50％时的免疫活性肽的浓度。