[发明专利]提取林木组织或器官RNA的方法和鉴定林木组织特异性miRNA的方法

权利要求书

1.一种提取林木组织或器官RNA的方法，其特征在于，包括：

将待处理样品与交联聚乙烯吡咯烷酮进行第一接触，并在液氮条件下进行研磨处理，将研磨处理后产物与Trizol、β-巯基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮进行第二接触。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：

(1)将第二接触后所得混合物与无水乙醇、KAc和氯仿/异戊醇混合液进行第三接触，冰置处理10min；

(2)将步骤(1)所得混合物进行第一离心处理，并将第一离心处理后的上层水相与氯仿进行第四接触，并将第四接触后产物进行震荡、静置和第二离心处理；

(3)将步骤(2)第二离心处理后上清与异丙醇和NaAc进行第五接触，并进行冰置、第三离心处理，以便获得RNA粗产物；

(4)将步骤(3)所得RNA粗产物进行洗涤处理；

(5)将步骤(4)所得洗涤处理产物进行第四离心和干燥处理，将干燥处理后产物与RNase-free水和DNA消化酶进行第六接触，将第六接触后产物进行水浴处理，并将水浴后产物与等体积的氯仿和异戊醇进行第七接触，将第七接触后产物进行第四离心处理；以及

(6)将步骤(5)所得第四离心处理后产物与无水乙醇和NaAC进行第八接触，将第八接触后产物进行静置和第五离心处理，收集沉淀物，所得沉淀物为样本RNA产物。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于0.1g的待处理样品，所述交联聚乙烯吡咯烷酮的用量为20mg，所述Trizol的用量为10微升，所述β-巯基乙醇的用量为1体积％，所述聚乙烯吡咯烷酮的用量为1体积％，

任选地，在步骤(3)中，所述异丙醇的用量为所述上清总体积的2/3体积。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，进一步包括：

以RNsae-free水为空白对照，使用Nanodrop仪测定所述RNA产物的A260与A280值，基于A260与A280值判定RNA产物的纯度和总量，使用Agilent 2100仪测定完整度，基于完整度判定RNA产物的完整性，

其中，A260与A280值在2.00-2.08，是RNA产物纯度合格的指示，

完整度在7.5～8.6，是RNA产物具有完整性的指示。

5.一种鉴定林木组织特异性miRNA的方法，其特征在于，包括：

利用权利要求1～4所述的方法提取林木组织或器官RNA；

利用所提取的RNA构建cDNA文库；

基于cDNA文库进行高通量测序；以及

根据测序结果及miRNA筛选标准，鉴定林木组织特异性表达的miRNA。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述cDNA文库是通过如下方式构建的：

small RNA两端加林木特异接头-条形码，所述林木特异接头-条形码为接头中含有组织特异性标记序列的条形码。

7.根据权利要求5所述的方法，所述组织或器官的数量至少为5个。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述林木特异的接头-条形码序列包括正链和负链，所述正链具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述负链具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述条形码序列具有SEQ ID NO：3～42所示核苷酸序列的至少之一。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征是，所述cDNA文库为经琼脂糖凝胶电泳回收得到的95-112bp的cDNA片段。