[发明专利]一种促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法及应用

说明书

本发明涉及一种促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法，该方法为在人羊膜上皮细胞培养过程中添加营养组合物，该营养组合物主要包括透明质酸、表皮细胞生长因子、维生素C、GlutaMAX™‑I添加剂、β‑巯基乙醇、甘氨酸、L‑丙氨酸、L‑天冬氨酸、L‑天冬酰胺、L‑谷氨酸、L‑脯氨酸、L‑丝氨酸等，其能显著促进人羊膜上皮细胞增殖，减少倍增时间，并维持人羊膜上皮细胞的细胞表面标志物表达、多向分化潜能和免疫耐受等生物学特性，而且还能显著增强人羊膜上皮细胞干性相关基因和免疫抑制因子的表达水平。因此，本发明营养组合物作为人羊膜上皮细胞增殖调节剂优势特色明显，对缓解再生医学领域种子细胞数量不足具有重要的临床意义。

技术领域

本发明属于干细胞生物技术领域，特别涉及一种促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法及应用。

背景技术

人羊膜上皮细胞是来源于胎盘的羊膜组织的上皮层，因羊膜属于分娩后的废弃物，故其不涉及医学伦理和法律问题。而且，人羊膜上皮细胞具有未分化的胚胎干细胞特性，能表达所有胚胎干细胞的分子标志物，具有向三个胚层组织分化潜能。且因其缺乏端粒酶，而规避了移植后的致瘤风险。人羊膜上皮细胞还不表达HLA抗原，移植后无免疫排斥反应，具有优良的移植免疫耐受特点，且能分泌多种免疫抑制因子和炎症抑制因子，抑制宿主T细胞免疫应答和炎性反应，避免了移植后的免疫排斥与炎症发生（Cell Transpl 2011;20:523-534；Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005;46:900-907）。因此，人羊膜上皮细胞是干细胞与再生医学领域的理想种子细胞新资源。

人羊膜上皮细胞来源便利，但因产妇个体差异也易导致所制备的干细胞质量参差不齐，影响临床使用效果。因此，类似其它来源干细胞的临床应用，人羊膜上皮细胞也无法回避临床应用所需足够的待移植供体细胞数量。通常，每张羊膜分离的上皮细胞有限，最多约2 × 10⁸个，仍需通过体外连续扩增才能达到临床所需的细胞数量级。但是，由于人羊膜上皮细胞缺乏端粒酶，体外扩增能力受到先天限制，较早进入衰老期，在常规体外扩增条件下，人羊膜上皮细胞只能传至5～6代。而且，在传代过程中，极易发生上皮-间质转化，从原代（P0）细胞到第5代(P5)细胞逐渐丧失其上皮特性，呈现间质表型。即上皮细胞的极性和表型丧失，呈现间质细胞表型及迁徙、侵袭特性。进而对人羊膜上皮细胞的生物学特性及功能存在潜在影响。因此，如何实现人羊膜上皮细胞体外高效扩增，并维持其自我更新、多向分化及免疫耐受等优良的生物学特性，已成为再生医学领域亟待解决的问题。Tamama 等的研究表明，表皮细胞生长因子EGF可促进人骨髓间充质干细胞（Stem Cells, 24(3): 686-695, 2006）；利用SFC、IL-3和IL-6等细胞因子，能使人骨髓间充质干细胞的增殖数量提高9倍（Stem Cells, 2006; 24(9): 2052-2059）；相比胎牛血清，人AB血清和凝血酶激活的富含血小板的血浆用于扩增人脂肪间充质干细胞，增殖倍率提高了2倍（Stem Cells, 2007;25(5): 1270-1278）。但是，国内外至今尚无促进人羊膜上皮细胞体外扩增的诱导剂或诱导方法方面的相关报道。

而且，借助细胞因子或其它外源诱导因子，促进干细胞体外扩增，其临床应用存在免疫原性、化学毒性等安全性问题，有较大的应用风险性。再者，通常细胞因子价格极其昂贵，限制了其用于临床。因而，发掘价廉易得、安全可靠、低毒高效的促干细胞体外扩增的诱导剂，或建立安全、可行、高效的诱导方法，对干细胞的临床应用具有巨大的现实意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种安全、高效、经济的促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法。

一种促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法，其具体步骤为：