[发明专利]一种番茄斑萎病毒属病毒基因及其应用

权利要求书

1.一种番茄斑萎病毒属病毒基因，其特征在于所述番茄斑萎病毒属病毒为辣椒黄化环斑病毒，其基因的碱基序列如SEQ ID NO:2所示，能够编码病毒的运动蛋白NSm和糖蛋白Gn或Gc；如SEQ ID NO:2所示的病毒基因序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示。

2.一种用于检测番茄斑萎病毒属病毒基因的检测试剂盒，其特征在于所述番茄斑萎病毒属病毒基因为如SEQ ID NO:2所示的辣椒黄化环斑病毒基因，试剂盒含有浓度为100pmol的正义引物50μL、浓度为100pmol的反义引物50μL、浓度为100pmol的探针50μL、RT-PCR反应液2.5ml；正义引物的序列为SEQ ID No:2中第1320-1340位，反义引物的序列为SEQ ID No:2中第2700-2720 位的互补序列，探针的序列为SEQ ID No:2中第1986-2200位。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于操作步骤如下：

病样总RNA的提取，去感病植物，液氮研磨后，提取病样的总RNA，用12µL总RNA为模板，1µL100µM下游引物混合，cDNA合成体系为20µL，70℃预变性10min后，迅速插入冰上5min，加入5×RT Buffer 4μL，10mmol/L dNTP 2μL，5U/μL M-MLV 1μL，40U/μL RNase Inhibitor 1μL，42℃延伸90min；以cDNA为模板或以带有进行PCR扩增；反应体系为50µL： cDNA 3µL，上游引物1µL，下游引物1µL，dNTP1µL，rTaq 1µL，10´buffer 5µL，H₂O 38µL；反应条件为：94℃下预变性4min；然后94℃下变性1min，55℃退火1 min，72℃下延伸1 min 30s，循环扩增30次；最后72℃下延伸10min；

PCR产物用UNIQ-10柱式PCR纯化试剂盒或UNIQ-10柱式胶回收试剂盒回收，回收的片段用于作为探针，或连接到pMD18-T载体上，连接体系：2.5μL Ligation mix，0.5μL pMD18-T，2μL PCR回收产物，16℃的条件下连接过夜；42℃热激转化到大肠杆菌DH5α，菌落PCR筛选阳性克隆，测序。