[发明专利]一种高通量的单细胞全基因组扩增方法

说明书

技术领域

本发明涉及单细胞全基因组扩增技术领域，尤其涉及一种高通量的单细胞全基因组扩增方法。

背景技术

研究表明，在胚胎发育、疾病发生与肿瘤发展等过程中，由于单个细胞的遗传物质个体化差异与异质性，导致极其重要甚至是决定性的后果，因此对单细胞的基因组进行测序研究是必要的。目前，单细胞的基因组测序已经成功地应用于各种微生物及哺乳动物细胞。

在单细胞研究工作中，扩大试验规模是确保采集足够多的生物多样性信息的关键。使用微流控芯片虽然可以将单个细胞分离，并进行样品扩增，但是通量不高。其它针对单细胞的方法均存在很多缺陷，导致检测灵敏度不高、基因表达信息丢失严重、技术噪音高、操作失误率高、重复性差，而且针对数以千计甚至万计的细胞数量时，实验费用又成为了最大的瓶颈，高昂的单细胞扩增的费用导致单细胞扩增仍然处于不成熟的阶段，在技术上和成本上还远没有达到大规模应用的地步。

目前，对单个细胞基因组DNA进行扩增应用最普遍、最简单的方法是多重置换扩增(multiple displacement amplification，MDA)技术，它利用随机引物和等温扩增可以获得大量高保真的DNA片段，但是该方法存在扩增偏倚及非特异扩增等问题。另外，其它发展的方法例如简并寡核苷酸引物聚合酶链反应(the degenerate oligonucleotide-primed polymerase chain reaction，DOP-PCR)由于其基因覆盖率比较低，不能检测单个核苷酸的变异。基于多重退火和循环的扩增循环(multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC)方法虽然能够抑制扩增偏倚，但是保真性较差，操作步骤相对复杂，不利于进行高通量的全基因组扩增(WGA)。

目前，商业化的单细胞WGA试剂盒不仅价格昂贵，试剂成分保密，而且反应体积都在几十微升(μL)左右，扩增产物存在偏倚。

发明内容

本发明提供一种高通量的单细胞全基因组扩增方法，具有高通量、低成本、单细胞、一体化的特点，能够实现单细胞全基因组扩增的自动化和规模化。

本发明的高通量的单细胞全基因组扩增方法，包括：采用纳升级的微量分液平台将具有预定细胞密度的细胞悬液分配到纳升级的微孔芯片的每个微孔中；采用上述微量分液平台将细胞裂解液分配到上述微孔中以裂解上述微孔内的细胞；采用上述微量分液平台将中和液分配到上述微孔中以进行中和反应；采用上述微量分液平台将全基因组扩增试剂分配到上述微孔中以进行全基因组扩增反应。

进一步地，上述全基因组扩增反应的同时采用荧光定量PCR仪辅助监测单细胞扩增情况。

进一步地，上述预定细胞密度是指2-4个细胞/微升。

进一步地，分配到上述微孔中的细胞悬液、细胞裂解液、中和液和全基因组扩增试剂的体积分别是35-50纳升、35-50纳升、35-50纳升和100-150纳升；优选地，分配到上述微孔中的细胞悬液、细胞裂解液、中和液和全基因组扩增试剂的体积分别是35纳升、35纳升、35纳升和100纳升。

进一步地，上述微孔芯片的每个微孔的容积为不小于250纳升。

进一步地，将上述细胞悬液、细胞裂解液、中和液和全基因组扩增试剂分配到上述微孔中后，通过离心去除气泡。

进一步地，上述荧光定量PCR仪辅助监测单细胞扩增情况中，以溶解曲线为单峰，同时Ct值介于阳性对照与阴性对照的数值之间，作为单细胞扩增产物的标志；其中上述阳性对照是总DNA，上述阴性对照是不含细胞的等渗溶液。

进一步地，上述方法还包括：去除最低和最高10％Ct值的样品。

进一步地，上述细胞裂解液包含200mM的KOH，100mM的DTT和5mM的EDTA；上述中和液包含333mM的Tris-HCl和125mM的HCl。

进一步地，上述方法还包括：吸取符合单细胞扩增产物的标志的样品，使用看家基因的引物进行PCR扩增检测，选择PCR扩增结果显示多条带的样品进行建库上机测序。

本发明的方法，以纳升级的微量分液平台为基础实现单细胞的分配，进而实现一系列的原位细胞裂解、中和反应和全基因组扩增反应等，而完成单细胞全基因组扩增，具有高通量、低成本、单细胞、一体化的特点，能够实现单细胞全基因组扩增的自动化和规模化。

附图说明