[发明专利]使用PEG化的量子点以在植物中稳定转化的线性DNA分子投递

说明书

本申请是2011年7月7日提交的申请号为201180038860.9(国际申请号PCT/US2011/043221)、发明名称为“使用PEG化的量子点以在植物中稳定转化的线性DNA分子投递”的发明专利申请的分案申请。

优先权要求

本申请要求2010年7月7日提交的美国临时专利申请流水号61/362,224关于“LINEAR DNA MOLECULE DELIVERY USING PEGYLATED QUANTUM DOTS FOR STABLE TRANSFORMATION IN PLANTS”的提交日权益。

技术领域

本发明涉及使用纳米颗粒以将线性核酸分子非侵入投递入具有细胞壁的植物细胞中的方法。

发明背景

纳米颗粒具有的独特性质已经被利用于将DNA投递至特定动物细胞。已经发现了，在将某些经DNA包被的纳米颗粒与没有细胞壁的细胞一起温育时，细胞吸收纳米颗粒，并开始表达DNA上编码的基因。也已经使用在大小范围3-5nm内的半导体纳米颗粒(例如，量子点(“QD”))作为载体来将分子投递入细胞中。DNA和蛋白质可以与附着于QD表面的某些配体连接。见例如Patolsky,等(2003)J.Am.Chem.Soc.125:13918。可以通过使用标准的生物缀合方案将经羧酸或胺包被的QD与含有硫醇基团(见例如Dubertret等(2002)Science 298:1759；Akerman,等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:12617；Mitchell,等(1999)J.Am.Chem.Soc.121:8122)，或N-羟基琥珀酰亚氨基(“NHS”)酯基的分子交联。见例如Pinaud等(2004)J.Am.Chem.Soc.126:6115；Bruchez等(1998)Science 281:2013。一种将分子附着于QD表面的备选方式是经由将经链霉抗生物素蛋白包被的QD与生物素化的蛋白质、寡核苷酸、或抗体缀合进行。见例如Dahan,等(2003)Science 302:442；Pinaud,等(2004)J.Am.Chem.Soc.126:6115；Wu,等(2003)Nature Biotechnol.21:41；Jaiswal,等(2003)Nature Biotechnol.21:47；及Mansson,等(2004)Biochem.Biophys.Res.Commun.314:529。

由于存在植物细胞壁，将外来核酸分子投递至植物是挑战性的。目前的方法依赖于侵入性投递以遗传转化植物。在植物细胞中，细胞壁是针对投递外源应用的分子的屏障。已经采用许多侵入性细胞投递方法，例如生物射弹(基因枪)、微注射、电穿孔、和土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化来实现基因和小分子对有壁的植物细胞中的投递，但是蛋白质的投递仅已经通过微注射实现。在用纳米颗粒将核酸分子投递至植物细胞是期望的情况中，在将颗粒添加至植物原生质体前除去细胞壁。见例如Torney,等(2007)Nature Nanotechnol.2:295-300。

发明概述

本文中描述了使用纳米颗粒和线性化的核酸分子以将感兴趣的分子导入具有细胞壁的植物细胞中的方法和组合物。可以使用公开内容的方法的一些实施方案来生成经稳定转化的经遗传修饰的能育植物。在一些实施方案中，线性核酸分子的独特特性容许投递没有外来核酸序列的感兴趣的特定基因序列，所述外来核酸序列对转基因靶生物体可以具有调节后果。

在一些实施方案中，纳米颗粒可以用线性核酸分子进行PEG化。在具体的实施方案中，纳米颗粒可以是半导体纳米颗粒，诸如量子点(“QD”)。在一些实施方案中，线性核酸分子可以是线性化的质粒DNA。在其它实施方案中，线性核酸分子可以包含编码膦丝菌素-N-乙酰基转移酶(PAT)和/或黄色荧光蛋白(YFP)的序列。

还公开了用于将感兴趣的分子导入具有细胞壁的植物细胞中的方法，其中该方法可以包括提供具有细胞壁的植物细胞；用PEG包被纳米颗粒的表面以生成“PEG化的”纳米颗粒；用至少一种感兴趣的线性核酸分子包被PEG化的纳米颗粒；将所述具有细胞壁的植物细胞和用感兴趣的线性核酸分子包被的PEG化的纳米颗粒置于彼此接触中；并容许所述纳米颗粒和所述感兴趣的线性核酸分子摄取入包含细胞壁的细胞中。