[发明专利]产3-羟基丙酸的重组菌及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了产3‑羟基丙酸的重组菌及其制备方法与应用。本发明公开的重组菌的构建方法，包括：敲除受体菌的fadR基因、fabF基因、fabH基因和向受体菌中导入acc基因或基因簇、alkL基因、mcr基因以及增强受体菌中fadL基因、fadD基因、sthA基因和atoSC基因簇的表达；受体菌为含有fadR基因、fabF基因和fabH基因的细菌或真菌。实验证明，利用本发明的重组菌以脂肪酸为原料生产3‑羟基丙酸的转化率为28.37％，表明，可以利用本发明的重组菌制备3‑羟基丙酸。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，产3-羟基丙酸的重组菌及其制备方法与应用。

背景技术

以化石资源利用为基础的化学品制造面临着资源枯竭和环境污染等日趋严重的问题。以生物合成路线实现传统化学品的低成本制造成为具有前景的替代手段。通过对工业微生物菌株进行遗传改造，可以改进微生物细胞对原料的利用、提高产品转化率，从而降低生产成本。

3-羟基丙酸是一种重要的化学中间体和具有广阔市场前景的平台化合物，也是美国能源部2004年列出的当前世界12种最具潜力开发的生物基化工产品之一。3-羟基丙酸不仅本身可以作为食品或饲料的添加剂和防腐剂，通过氧化、脱水、还原、酯化、聚合等反应可以合成多种重要的化学品，包括丙烯酸、丙二酸、1，3丙二醇、丙烯酰胺、聚3-羟基丙酸等。

目前生产3-羟基丙酸的方法主要包括化学合成方法和生物合成方法。制备3-羟基丙酸的化学方法包括3-羟基腈水解法、水合丙烯酸法、3-羟基丙醛氧化法、丙烯醇氧化法等。3-羟基丙酸的生物法合成方法主要是利用微生物发酵将原料转化为3-羟基丙酸，或将相关酶提取后在无细胞体系中生产3-羟基丙酸。微生物合成3-羟基丙酸的研究主要包括三个方面：(1)筛选、诱变天然合成3-羟基丙酸的微生物菌株；(2)构建重组微生物工程菌株利用葡萄糖产3-羟基丙酸；(3)构建微生物工程菌株利用甘油生产3-羟基丙酸。

筛选、诱变天然合成3-羟基丙酸的微生物主要集中在假丝酵母，但由于假丝酵母合成3-羟基丙酸通常需要以丙酸为碳源，经济可行性较差。

以葡萄糖为底物合成3-羟基丙酸的重组微生物工程菌株构建主要包括大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等。工程菌株合成3-羟基丙酸主要利用了两类合成途径：(1)经3-羟基丙酰辅酶A的合成途径；(2)经丙二酸单酰辅酶A的合成途径。美国Cargill公司以经3-羟基丙酰辅酶A途径为基础，利用大肠杆菌等工程菌株中将葡萄糖转化为乳酸，然后经过丙酰辅酶A转移酶、乳酰辅酶A脱水酶和3-羟基丙酰水解酶的催化等三步反应生成3-羟基丙酸。美国OPX生物公司利用经丙二酸单酰辅酶A的途径，通过乙酰辅酶A羧化酶和丙二酸单酰辅酶A还原酶的催化将底物转化为3-羟基丙酸。

以甘油为底物合成3-羟基丙酸的重组微生物工程菌株构建主要通过在克雷伯氏肺炎杆菌或者大肠杆菌中引入醛氧化酶将3-羟基丙醛氧化成3-羟基丙酸。

目前生物法合成3-羟基丙酸的主要技术限制是原料价格相对较高，所采用途径的理论转化率低，亟待开发新的低成本原料路线。脂肪酸是一类具有高度还原状态的物质，用于微生物发酵、生物转化的脂肪酸原料可以从油料粗加工产物、地沟油等来源以低廉的价格获取。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何生产3-羟基丙酸。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了重组菌的构建方法。

本发明所提供的重组菌的构建方法，包括对受体菌进行甲或乙的改造，得到所述重组菌；所述甲为A6；所述乙为A6以及A1、A2、A3、A4、A5、A7和A8这七种中的全部或部分；

A1、敲除所述受体菌的脂肪酸降解转录因子fadR基因或抑制除所述fadR基因的表达或抑制所述fadR基因编码的蛋白质的活性；