[发明专利]一种从马血中提取乙酰胆碱酯酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶的提取方法，具体是一种从马血中提取乙酰胆碱酯酶的方法。

背景技术

乙酰胆碱酯酶是生物神经传导中的一种关键性的酶，在胆碱能突触间，该酶降解乙酰胆碱，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内的正常传递。由于乙酰胆碱酯酶对于乙酰胆碱的高速水解作用，使得其近年来得到越来越多的研究人员的关注。乙酰胆碱酯酶在生物防治、农药残留检测、分子生物学以及各种神经性疾病治疗方面有广泛的应用。最近研究表明，氨基甲酸乙酯在一定程度上可以抑制乙酰胆碱酯酶的活性，因此乙酰胆碱酯酶有可能应用在氨基甲酸乙酯的检测上。

乙酰胆碱酯酶广泛存在于各种动植物组织中，对于动物来说，主要集中在肝脏、血液和脑组织中。现有的乙酰胆碱酯酶的提取方法普遍存在酶活性差的缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从马血中提取乙酰胆碱酯酶的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种从马血中提取乙酰胆碱酯酶的方法，步骤如下：

1)取新鲜马血，加入混合缓冲提取液，在4℃冰浴、100-200rpm的转速下搅拌混合15-20min，获得第一混合液；

2)将第一混合液在0-4℃下静置12-24小时，获得第二混合液；

3)将第二混合液在4℃冰浴、300-400rpm的转速下匀浆8-12min，获得第三混合液；

4)将第三混合液在4℃、7500-8000rpm的条件下冷冻离心23-28min，取上清液，获得第四混合液；

5)采用Procainamide亲和层析法对第四混合液进行纯化处理，获得初次纯化物；

6)采用SephadexG-200凝胶柱对初次纯化物进行纯化处理，获得最终纯化物；

7)将最终纯化物浓缩，干燥，即得产品。

作为本发明进一步的方案：步骤1)中，所述混合缓冲提取液的加入量为所用的新鲜马血体积的3-5倍。

作为本发明再进一步的方案：步骤1)中，所述混合缓冲提取液中含有质量百分比为0.5-0.8％的聚乙二醇辛基苯基醚，余量为磷酸盐缓冲液。

作为本发明再进一步的方案：步骤1)中，所述混合缓冲提取液的pH为7.2-7.6。

作为本发明再进一步的方案：步骤5)中，体系pH为7.3。

作为本发明再进一步的方案：步骤6)中，体系pH为7.5。

作为本发明再进一步的方案：步骤7)中，采用透析法于4℃下浓缩最终纯化物，然后进行真空冷冻干燥。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提取方法所获得的乙酰胆碱酯酶的酶活性高，纯度高，灵敏度高的优点，且所制得的产品为粉末状，易于存储，具有广阔的市场前景。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1

一种从马血中提取乙酰胆碱酯酶的方法，步骤如下：

1)取新鲜马血，加入混合缓冲提取液，在4℃冰浴、100rpm的转速下搅拌混合15min，获得第一混合液，其中，所述混合缓冲提取液的加入量为所用的新鲜马血体积的3倍；所述混合缓冲提取液中含有质量百分比为0.5％的聚乙二醇辛基苯基醚，余量为磷酸盐缓冲液；所述混合缓冲提取液的pH为7.2；

2)将第一混合液在0℃下静置12小时，获得第二混合液；

3)将第二混合液在4℃冰浴、300rpm的转速下匀浆8min，获得第三混合液；

4)将第三混合液在4℃、7500rpm的条件下冷冻离心23min，取上清液，获得第四混合液；

5)采用Procainamide亲和层析法对第四混合液进行纯化处理，获得初次纯化物，其中，Procainamide亲和层析体系pH为7.3；

6)采用SephadexG-200凝胶柱对初次纯化物进行纯化处理，获得产物，其中，SephadexG-200凝胶柱体系pH为7.5；

7)将最终纯化物浓缩，干燥，即得产品，具体为，采用透析法于4℃下浓缩最终纯化物，然后进行真空冷冻干燥，获得产品。

实施例2

一种从马血中提取乙酰胆碱酯酶的方法，步骤如下：