[发明专利]一种重组耶氏解脂酵母菌株及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种重组耶氏解脂酵母菌株及其构建方法和应用。本发明在耶氏解脂酵母菌株中以葡萄糖为碳源实现甾体药物重要中间体孕烯醇酮的生物全合成，在重组耶氏解脂酵母菌株中，野猪来源mCYP11A1与牛来源的mAdR和mAdX的组合具有最佳的生产孕烯醇酮的效果。利用本发明所述重组耶氏解脂酵母菌株生产孕烯醇酮相对于生物转化方法生产孕烯醇酮步骤简单且污染小，同时解决了酿酒酵母中生物全合成孕烯醇酮对后续甾体药物生产的瓶颈问题，为孕烯醇酮的工业生产提供了一种可行的办法，并为下游孕酮、雄烯二酮、糖皮质激素等甾体激素类药物的合成打下基础。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种重组耶氏解脂酵母菌株及其构建方法与应用。

背景技术

目前，甾体激素类药物是仅次于抗生素的第二类药物，在制备保健品、治疗呼吸系统疾病、内分泌失调、淋巴白血病、风湿病以及皮肤病等方面被广泛应用。作为制备各种甾体类药物的原材料，甾体激素中间体应用广泛，具有重要的医药价值和巨大的市场需求。其中一个重要中间体孕烯醇酮(pregnenolone)其合成是所有甾体激素合成的第一步也是限速步骤。该步骤由一个细胞色素P450侧链降解酶系统(P450scc)催化，包含细胞色素氧化酶CYP11A1及其电子传递系统中伴随蛋白铁氧还蛋白AdX和铁氧还蛋白还原酶AdR。具体反应如图1所示，首先NADPH通过AdR将电子传递给AdX，AdX再将电子传递给CYP11A1，继而CYP11A1催化胆固醇及其类似物生成孕烯醇酮。

一直以来，孕烯醇酮合成所涉及的P450电子传递系统这三种组分间适配性复杂，酶促反应效率较低，因此P450scc的优化和孕烯醇酮产量的提高始终是科学家研究的热点。2008年，Novikova.L.A研究组在耶氏解脂酵母菌株(Yarrowia lipolytica)中构建了人(Homo sapiens)来源AdX、AdR与人(Homo sapiens)和牛(Bos taurus)来源CYP11A1的P450scc表达体系，通过胆固醇添加实现了由胆固醇到孕烯醇酮的生物转化，但转化效率非常低，24h后检测到的孕烯醇酮占总甾醇比例仅为8％。2013年该课题组又在大肠杆菌中构建了牛的侧链降解系统，再次实现了胆固醇的生物转化，孕烯醇酮产量仅为420μg/L。2015年俄国另一研究者Adrian Gerber发表了在巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)中胆固醇及其类似物的生物转化的研究结果，推测利用该菌株内PHB颗粒的原位催化效应使孕烯醇酮提高到了95mg/L。

虽然利用微生物转化法生产孕烯醇酮与传统方法相比具有很大优势，规避了化学合成步骤繁多、有机试剂排放等诸多弊端。但由于该反应是在微生物胞内甾体转化酶的催化作用下完成的，而甾体类物质通常具有较强的疏水性，一般很难溶解在培养基中，普遍采用的环糊精包埋方式也很难被微生物细胞吸收与酶接触反应，严重限制孕烯醇酮的生成。而合成生物学的快速发展使微生物中从头合成天然产物成为可能，利用简单碳源(如葡萄糖)对孕烯醇酮进行生物全合成，一方面可以规避疏水性底物添加造成的底物利用率低，另一方面还可以降低投料成本，更加有利于工业化生产。但是利用合成生物学方法在酵母菌株中从头合成孕烯醇酮相比于胆固醇添加的生物转化方法，其代谢路径更长、涉及到的基因更多、代谢调控更加复杂，因此在更具潜力的同时困难也更大。1998年，CatherineDuport在合成菜油甾醇基础上，于酿酒酵母中共表达牛细胞侧链降解酶系统P450scc，实现了单一碳源到孕烯醇酮的生物全合成，使产量达到60mg/L。但酿酒酵母中孕烯醇酮多以酯化形式存在，且甾体类物质通常具有较强的疏水性，在体内的储存及转运将成为制约后续甾体药物生产的瓶颈。而耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica)是一种需氧的、无致病性的二型性非常规酵母。该酵母因其可以有效地利用碳水化合物或疏水性底物为唯一碳源进行生长繁殖而得到研究人员的关注。因此，亟待开发利用简单碳源(如葡萄糖)对孕烯醇酮进行生物全合成，高产孕烯醇酮的耶氏解脂酵母。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种合成孕烯醇酮的重组耶氏解脂酵母菌株及其构建方法与应用。