[发明专利]一种生产原人参二醇的基因工程菌及其方法

说明书

本发明公开了一种生产原人参二醇的基因工程菌，其是在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达鲨烯合酶基因、2,3‑氧化鲨烯合酶基因、达玛烯二醇合酶基因、原人参二醇合酶基因以及烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸‑细胞色素P450还原酶基因的工程菌。利用该基因工程菌生物合成原人参二醇，具有发酵时间短、培养基简单、符合现代工业的要求以及利于推广应用等优点。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种原人参二醇的生物合成方法及其生产菌株。

背景技术

原人参二醇(PPD)属于四环三萜类化合物，为人参二醇型皂苷Ra1、Ra2、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg3和Rh2等的苷元，主要来源于人参、三七、西洋参等五加科植物以及葫芦科植物如绞股蓝等。具有抗肿瘤、抗抑郁、提高人体免疫力等作用。目前主要来至于人参植物的提取，成本高，效率低下，其来源受到自然环境的限制，如土地的投入量、气候等。

合成生物学是21世纪初诞生的一门新兴工程学科，是以工程学和生物学为基础，以创新为导向迅速发展起来的新研究领域,希望解决生物化工、生物能源、生物材料、生物医药领域以及关系国计民生等的大问题。合成生物学的出现为植物天然药物的快速生产建立了有效的途径，有望成为未来最有前途的药物生产的绿色环保技术之一,可以有效解决植物来源的天然药物研发可能引起的资源问题。植物天然药物生物合成取得了引人注目的成就，如紫杉二烯、青蒿素、胡萝卜素等。这些研究不仅印证了通过合成生物学的设计，实现珍稀植物次生代谢产物的异源生物合成的可行性，其研究结果也显示这一技术的巨大优势和应用潜力。

目前，利用合成生物学原理设计和改造微生物菌株已实现了多种植物活天然药物的异源生产，最常用的微生物宿主为酿酒酵母和大肠杆菌。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种真核生物，因其具有内膜系统，更适合包括P450氧化酶等基因在内的植物次生代谢酶基因的表达。目前，已有不少植物天然药物在酿酒酵母中实现了生物合成。戴住波(Zhubo Dai)等通过在酿酒酵母中引入达玛二烯合酶、原人参二醇合酶和NADPH细胞色素P450酶，产生0.05mg/g原人参二醇；进一步通过引入截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A、鲨烯合酶、2,3-氧化鲨烯合酶以及密码子优化原人参二醇合酶，导致原人参二醇262倍的增长；进一步通过双向萃取发酵技术发酵96h,获得原人参二醇8.40mg/g(1189mg/L)和达玛烯二醇10.94mg/g(1548mg/L)。该方法的主要不足之处在于发酵时间太长(专利申请CN 102925376AZhubo Dai Yiliu Xianan Zhang etal.Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production ofginsenosides[J].Metabolic Engineering,2013,20 146-156.)。但酿酒酵母作为真核生物，利用其生物合成目标物质时，具有发酵周期长，遗传操作复杂，不易于高密度发酵等不足，限制了酿酒酵母在植物次生代谢产物生物合成中的应用。

E.coli是所有工程菌中开发最早、最成熟的一种，而且具有生长速度快，发酵时间短、培养基简单等优势，使得大肠杆菌在工业生产中有着酿酒酵母无法比拟的优势，更节能，更有效率；以及大肠杆菌基因组较小，遗传工具、技术及相关知识非常清晰，非常符合现代工业的要求，这些优势也是酿酒酵母无法比拟的，因此成为植物次生代谢产物合成生物学研究中首选的宿主菌。目前，几乎各大类天然产物，如聚酮类(如红霉素)、非核糖体肽类(如埃博霉素)、萜类化合物(如紫杉二烯)、苯丙烷类(如白藜芦醇)、生物碱类((S)-网状番荔枝碱)等化合物都在大肠杆菌有异源合成的成功报道。大肠杆菌中没有原人参二醇生物合成所需的鲨烯合酶、2,3-氧化鲨烯合酶、达玛烯二醇合酶、原人参二醇合酶以及烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶等相关基因，因此，利用大肠杆菌生物合成原人参二醇，需要导入鲨烯合酶、2,3-氧化鲨烯合酶、达玛烯二醇合酶、原人参二醇合酶以及烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶等相关基因，通过发酵，最终获得产原人参二醇大肠杆菌。