[发明专利]一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法

说明书

本发明公开了一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法，涉及病原的分离和培养领域。包括病斑采集、消毒处理、分离培养、病原纯化、培养病原藻五个步骤，另外本发明还提供了培养山茶藻斑病病原的Chu10营养液和Chu10营养基。本发明的有益效果在于：本发明山茶藻斑病病原的分离和培养方法，它能快速有效的将山茶藻斑病病原分离和培养，防止受到细菌和真菌的污染，整个过程污染少，周期短，纯化效果好。

技术领域

本发明主要涉及病原的分离和培养领域，具体是一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法。

背景技术

山茶(Camellia japonica)是重要绿化苗木之一。随着山茶花生产基地的不断扩大，园林绿化的普遍应用，国内外品种的频繁交换，苗木大范围的运输流通，再加上全球气候变暖等因素，山茶花的病害发生呈上升趋势，尤以山茶藻斑病的发生最为明显。山茶藻斑病发生于植株叶片及嫩枝上，以叶片为主。发病初期，感病叶片上产生细小圆点，灰绿色或灰白色，上覆疏松污白色丝状物，放射状向四周扩展，以后逐渐扩展，形成圆形或不规则形病斑，病斑中部灰褐色或深褐色，边缘仍为绿色，病斑稍隆起，表面呈毛毡状，直径0.5-1.2cm，病斑背面凹陷。

山茶藻斑病的发生轻则影响植株正常生长，导致植株生长不良、品质下降，从而丧失观赏价值及绿化效果；重则引起整株死亡，造成重大经济损失，给山茶花产业带来较大影响。在生产实践中，人们主要使用化学农药来控制山茶藻斑病的发生，但药剂防治的关键期和施药次数的确定主要是凭经验，缺乏科学依据，以致防治效果不理想，而只有掌握了病原的生理特性和侵染循环，才能科学的制定防治时期和防治对策。但是山茶藻斑病的病原分离困难，一般分离时易受细菌和真菌的污染，因此，急需建立山茶藻斑病病原的分离和培养方法，继而研究病原的生理特性及与病害发生的内在关系，为该病害的有效防控提供理论依据。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法，它能快速有效的将山茶藻斑病病原分离和培养，防止受到细菌和真菌的污染。

本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：

一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法，包括病斑采集、消毒处理、分离培养、病原纯化、培养病原藻，具体步骤如下：

步骤一：病斑采集：采集新鲜的病叶标本装入洁净的保鲜袋，带回实验室用自来水冲洗20-30min，备用；

步骤二：消毒处理：选择步骤一中病斑较多的叶片，在超净工作台无菌环境下，用无菌剪刀剪下直径4-6mm的病组织圆片，用体积比75％的酒精处理20-30s，然后用无菌水冲洗4-6次，备用；

步骤三：分离培养：将步骤二中经无菌水冲洗的病组织用无菌滤纸吸取表面水分，然后用镊子将病组织分别放入到Chu10营养基或营养液中，编号、密封后放入到温度22-28℃的光照培养箱内，按照光照12h，黑暗12h进行培养7-10d，观察其变化；

步骤四：病原纯化：待步骤三中培养的病组织周围有疑似藻类产生，分别将藻类似物在装有Chu10营养基的培养皿上斜45度角涂抹4-5次，做好标记，放入到温度22-28℃的光照培养箱内，按照光照12h，黑暗12h进行培养，得到藻类病原；

步骤五：培养病原藻：将步骤四中分离得到的藻类病原，转接到Chu10营养液中，然后在温度22-28℃、光照12h、黑暗12h的条件下以50-100r/min的转速摇床振荡培养7-10d，最终得到纯化的山茶藻斑病病原。