[发明专利]重组蛋白、其编码基因、其应用及猪流行性腹泻病毒抗体的检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明提供了一种重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种如SEQ ID No.2所示的基因。本发明还提供了一种如上所述的蛋白在检测猪流行性腹泻病毒抗体中的应用，主要是作为包被抗原使用。本发明还提供了一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的试剂盒，包括：如上所述的重组蛋白、包被液、洗涤液、封闭液、稀释液、辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG和底物显色液。本发明以SEQ ID No.1所示的重组蛋白作为包被抗原，采用间接ELISA检测猪流行性腹泻病毒抗体，具有较好的特异性、敏感性及重复性，结果直观准确。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种重组蛋白、其编码基因、其应用及猪流行性腹泻病毒抗体的检测试剂盒及检测方法。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是导致初生仔猪死亡的重要传染病之一。该病由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起，以腹泻、呕吐、脱水和哺乳仔猪高死亡率为特征。PED于1971年首次发生于英国的生长育肥猪群，随后在欧洲其他国家以及亚洲相继发生。1976年我国广东、上海、黑龙江等地发生PED，随后该病在国内猪场呈地方流行性形式流行，并从患病猪群分离到了PEDV。2010年10月，由PEDV变异株引起的初生仔猪腹泻在我国暴发流行，迅速在全国各地传播。此次流行以7 10d龄内的哺乳仔猪受害最严重，其发病率高达100％，死亡率达50％～90％，给我国养猪生产造成了巨大经济损失。

PEDV属于冠状病毒科冠状病毒属成员，基因组全长约28kb，为线性单股正链RNA病毒。病毒基因组编码4种结构蛋白：纤突蛋白(S)、小膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)，其中S蛋白位于病毒粒子表面，是PEDV最重要的结构蛋白，由1383aa组成，包括信号肽、中和表位、跨膜区和胞浆区。S蛋白可以分为S1(1-789aa)和S2(790-1383aa)两个区域，S1区位于病毒表面，可与宿主细胞上的受体结合，能诱导中和抗体的产生；S2区位于病毒内部，介导病毒与宿主细胞的融合。因此，S蛋白是PEDV感染免疫研究和疫苗设计的主要靶蛋白，S蛋白抗体水平及其变化动态是评价免疫效果和监测免疫状态的重要依据，同时也可以作为PEDV感染血清流行病学调查的重要指标。丁振江等(2014)基于重组PEDV S1蛋白建立了PEDV IgA抗体间接ELISA方法，华耀等(2016)建立了基于PEDV S蛋白的PEDV IgG间接ELISA方法。由于S1蛋白区域是诱导机体保护性免疫应答的主要区域，所以针对该区域的特异抗体水平更能够间接反映疫苗诱导的免疫保护水平和机体抗感染免疫水平。已知血清PEDV抗体与局部黏膜免疫水平具有正相关性，而检测血清IgG抗体ELISA方法的应用范围更加广泛。因此，非常有必要建立基于S1蛋白的IgG抗体ELISA检测方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组蛋白、其编码基因、其应用及猪流行性腹泻病毒抗体的检测试剂盒和检测方法，本发明提供的检测方法简便、特异性、灵敏性和稳定性强。

本发明提供了一种重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种编码如上所述的重组蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明提供的重组蛋白可作为包被抗原，利用间接ELISA法对猪流行性腹泻病毒抗体进行检测。

本发明还提供了一种如上所述的重组蛋白在检测猪流行性腹泻病毒抗体中的应用，主要是作为包被抗原使用。

本发明还提供了一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的试剂盒，包括：如上所述的重组蛋白、包被液、洗涤液、封闭液、稀释液、辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG和底物显色液。

其中，所述封闭液为含5％新生牛血清的PBST溶液。

本发明还提供了一种猪流行性腹泻病毒抗体的检测方法，包括以下步骤：