[发明专利]一种环己酮单加氧酶及其在合成拉唑中的应用

说明书

本发明公开了一种环己酮单加氧酶及其在合成拉唑中的应用，特别是公开了一种通过定点突变获得的环己酮单加氧酶，与SEQ ID No.1相比，其氨基酸序列在以下至少一个位点发生基因突变：第435位丝氨酸Ser突变成苏氨酸Thr。实验表明，本发明的环己酮单加氧酶能够将高浓度的奥美拉唑硫醚中间体IV催化转化成埃索美拉唑中间体V的环己酮单加氧酶。

技术领域

本发明属酶工程技术领域，涉及一种通过基因定点突变获得的单加氧酶及其应用，特别涉及一种环己酮单加氧酶及其在合成拉唑中的应用。

背景技术

埃索美拉唑和奥美拉唑都是用于治疗胃溃疡的质子泵抑制剂(Proton pumpinhibitors，PPIs)，其中埃索美拉唑是S构型的奥美拉唑，其化学名称为5-甲氧基-2-((S)-((4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基)亚硫酰基)-1H-苯并咪唑，CAS登录号为119141-88-7，化学结构如下式I所示。奥美拉唑的化学名称为5-甲氧基-2-(((4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基)亚硫酰基)-1H-苯并咪唑，CAS登录号为73590-58-6，其化学结构如下式II所示。

与奥美拉唑相比，埃索美拉唑具有肝脏首过效应低、血药浓度高、血浆半衰期长、生物利用度高、药物间相互作用小、药效强而持久等优势，尤其适合用于特殊人群，如老年人、肾功能不全和轻中度肝功能不全患者。此外，埃索美拉唑还适用于已经治愈的食管炎患者防止复发的长期维持治疗，与适当的抗菌疗法联合用药可根除幽门螺杆菌，并且能愈合与幽门螺杆菌感染相关的十二指肠溃疡，防止与幽门螺杆菌相关的消化性溃疡复发。埃索美拉唑以其卓著的品质名列2004年全球畅销药物第5位，销售额高达43亿美元。

目前，已报道的埃索美拉唑的化学合成方法主要有拆分法和氧化法。酶法生物催化近年来由于其高效、高选择性的催化性能，在不对称合成领域中得到广泛的关注，同时由于酶的高度专属性，使得酶催化使用范围并不广，不同的底物需要特殊的突变酶才能实现有效的催化效果。美国科德克希思公司在CN102884178 A公开了一种进行基因突变的，获得非天然存在的单加氧酶，NCBI登录号为578026767(本申请命名为SEQ ID NO:1)，高选择性用于催化单加氧合成拉唑类化合物，然而其一批反应可催化的底物浓度比较低(33g/L)，不利于工业化大规模应用。本申请人之前也对相关酶进行改造，提高了反应底物浓度，达到了更好的催化效果，较佳的实现工业化。然而先前报导的这些单加氧酶均只能在制备拉唑最后原料药单加氧中的使用才能获得催化效果，但是药品原料制造过程中对产后原料的高质量要求，除了对有机化学杂质高要求之外，对溶剂残留、挥发等也有高严格的要求，酶本身是一种蛋白，在用于催化反应时，自身的裂解可能导致大量的氨基酸等残留，该些杂质残留后期在原料药纯化工艺较难除去，需要多次结晶工艺或者其他纯化途径，以到达原料药的质量需求，以致酶催化反应在最后一步用于原料药制备工艺中难以被广泛的接受应用，目前最后一步工艺中采用酶法催化产物蛋白残留大于0.1％，后期需要多次重结晶纯化或者特殊过滤出来。

发明内容

为了克服现有的生物酶合成法直接应用于最后原料药中存在缺陷，本发明利用基因工程技术来对现有技术的环己酮单加氧酶进行改造和筛选，构建高酶活性的单加氧酶，从而可催化高浓度的奥美拉唑硫醚中间体底物转化为埃索美拉唑中间体，最后通过化学法生成埃索美拉唑。

本发明的第一个目的是提供一种环己酮单加氧酶，其能够将高浓度的奥美拉唑硫醚中间体底物(式IV)催化转化为埃索美拉唑中间体底物(V)。

其中，所述的环己酮单加氧酶与SEQ ID No.1相比，环己酮单加氧酶的氨基酸序列至少以下一个位点发生基因突变：第435位丝氨酸(Ser)突变成苏氨酸(Thr)获得本发明的环己酮单加氧酶基因，其中SEQ ID No.1是现有的NCBI登录号为578026767的环己酮单加氧酶的氨基酸序列。