[发明专利]一种高效扩增NK细胞的方法

说明书

本发明涉及细胞培养技术领域，本发明的培养方法培养的NK细胞纯度高，数量大。本发明通过主要通过环孢素A、氢化可的松、IL‑2、CS1单抗、IL‑2、IL‑15联合使用来实现NK细胞的活化及扩增。本发明对具体的培养方法也进行描述，包含抗体的包被、NK细胞的活化及NK的扩增。本发明避免的饲养细胞的污染并且简化了流程，最大程度的避免了污染；同时培养的NK细胞纯度高，周期短，并且获得的NK具有较高的杀伤活性。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种NK细胞培养组合物及其培养方法。

背景技术

自然杀伤(Nature Killer，NK)细胞，是一种自然杀伤细胞，它是除T淋巴细胞、B淋巴细胞之外的第三类淋巴细胞。它作为人体第一道防线，能够清除病毒、细菌等有害物质，同时还可以清除衰老、病变及癌变的细胞，从而维持人体的健康。

NK作为重要免疫效应细胞，不需要预先致敏即可直接杀伤病毒感染或异变的靶细胞，同时具有以下特征：1、无需特异性抗原识；2、直接杀伤靶细胞；3、不受MHC限制；4、具有较广的抗瘤谱；5、基本无不良反应。在控制癌症的发生和发展中起着非常重要的作用。其可以通过释放穿孔素/颗粒酶、ADCC效应、Fas/FasL系统及NK细胞毒因子消灭人体内的病毒、细菌以及癌细胞。

过继免疫治疗已经成为肿瘤免疫治疗的主要方式之一，它主要包括特异性的TIL、TCR、CAR-T、CAR-NK和非特异性的CIK、DC、NK等。正是由于以上NK其独特的特点，其在肿瘤免疫治疗中的应用越来越受到重视。研究显示：衰老及肿瘤病人的的NK细胞数量降低而且活力也降低了。在日本，NK细胞不仅广泛用于癌症病人治疗，还应用于亚健康人群，预防癌症发生。因此，如何获得大量的NK细胞成为目前亟待解决的问题。

目前，NK细胞的大量获得仍然主要是通过与X射线辐射过的K562作为饲养细胞共培养获得；或者是采用磁珠分选及流式分选。但是这些方法都有明显的缺点。使用饲养绌胞无疑引入了外源性的细胞，增加了临床应用的风险；而磁珠分选及流式分选操作繁琐，无疑增加了细胞污染的风险，并且成本也较高。因此，研发一种低风险、低成本的NK细胞培养方法称为一个亟待解决的问题。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种无需滋养细胞激活NK细胞体外扩增活性技术，解决了外源性细胞引入的问题，增加了安全性；同时在本发明中无需通过流式分选及磁珠分选来纯化NK细胞，简化了操作流程且大大降低了成本。

本发明所采用的技术方案是：

对从外周血中分离PBMC细胞进行活化，活化后再进行扩增培养。主要包括以下几个步骤：

(1)抗体包被

用PBS稀释CS1单抗，并用稀释好的单抗包被T75培养瓶，抗体包被浓度为10-60μg/mL.然后置于4℃孵育过夜或者37℃培养箱中孵育2h。

(2)PBMC分离及自体血清制备

使用Ficoll分离人血中的PBMC，并使用X-VIVO15培养基将PBMC的浓度调整至约1×10⁶个/mL。同时将分离得到的血浆于56℃进行灭活30min。然后离心后取上清并于4℃储存备用。

(3)NK细胞活化培养

将分离后的细胞转移至包被并用PBS清洗过的培养瓶中。然后加入IL-2、氢化可的松及环孢素A，它们的终浓度约为500-1000IU/mL、10^-4μM/L及50-100ng/mL。最后加入7-10％的自体血清。

(4)NK细胞的扩增培养