[发明专利]一种基于核酸的生物逻辑门与逻辑电路的构建方法

权利要求书

1.一种基于核酸的生物逻辑门与逻辑电路的构建方法，其特征是，包括以下步骤：

(a)利用提取试剂盒从肿瘤细胞中提取出具有标志性作用的 Micro-RNA；

（b）将构成逻辑门的底链核酸与表面羧基修饰的磁珠混合，使用浓度为0.2mol/L的NHS将底链核酸上修饰的氨基进行活化，使浓度为用0.8mol/L的EDC使磁珠上修饰的羧基进行活化，EDC 与NHS 两者共同作用，促进所以与氨基间缩合反应的进行,通过缩合反应，利用肽键将两者链接在一起；

(c)利用磁力架将溶液中未链接的底链核酸与磁珠进行分离，反复清洗三次后加入信号链，利用碱基的互补作用使信号链与底链结合，形成运算模块，同时利用磁性分离技术将未结合的信号链进行分离， 使用缓冲液反复清洗三次待用；

(d)加入输入链Micro-RNA，在反应温度为 37℃下反应 2 小时，反应使用的缓冲液为PH=7.5 、浓度为 0.8 mol/L 的 Tris 缓冲液；反应过程中，由于输入链与底链的碱基互补配对数要大于信号链与底链的碱基互补配对数，便可以利用链取代技术实现输入链Micro-RNA 对信号链的取代，之后利用磁性分离技术将取代下来的信号链与运算模块分离，并使用缓冲液反复清洗三次待用；

(e)在一定的反应条件下，将清洗好的信号链与Hemin 混合，在 HEPES 缓冲体系下于95℃下恒温振荡 5min 后缓慢冷却至室温，随后置于 37℃的摇床中振荡反应 1 小时，使其形成具有催化作用的G-四联体结构；之后储存于 25℃环境下待用；

(f)将形成的 G-四联体结构加入ABTS-H₂O₂ 体系中去，其反应环境为 PH=7.5 浓度为0.8 mol/L 的Tris 缓冲体系，加入比色皿中，检测样品在特定时间内，在 414nM 波长下的吸收情况，并对应逻辑运算中的真与假；

(g)将所构建的的每一个独立的逻辑门串联与并联组合的方式形成逻辑电路。

2.根据权利要求 1 所述的一种基于核酸的生物逻辑门与逻辑电路的构建方法，其特征在于：步骤（a） 中所指 Micro-RNA 为 MiR-21、MiR-182、MiR-195。

3.根据权利要求 1 所述的一种基于核酸的生物逻辑门与逻辑电路的构建方法，其特征在于：步骤（b） 中所述的方法，其所述的NHS 使用浓度为 0.2 mol/L，EDC 使用浓度为0.8 mol/L。

4.根据权利要求 1 所述的基于核酸的生物逻辑门与逻辑电路的构建方法，其特征在于：步骤（b）中所述的方法，其所述的反应条件为NHS 常温活化羧基修饰磁珠 30 分钟后，加入底链核酸 37℃摇床振荡反应 12 小时 。

5.根据权利要求 1 所述的基于核酸的生物逻辑门与逻辑电路的构建方法，其特征在于：步骤（c）中所采用的底链和信号链的比例为 1:2。

6.根据权利要求 1 所述的基于核酸的生物逻辑门与逻辑电路的构建方法，其特征在于：步骤（c）中所采用的反应条件为 37℃下振荡反应 1 小时。

7.根据权利要求 1 所述的基于核酸的生物逻辑门与逻辑电路的构建方法，其特征在于：步骤（d）中所采用的加入的Micro-RNA 量与与运算模块的体积比为 2:1。

8.根据权利要求 1 所述的基于核酸的生物逻辑门与逻辑电路的构建方法，其特征在于：步骤（e）中所采用的Hemin 浓度为 7x10^-7 mol/L 且与 HEPES 缓冲液体积比为 1:12。

9.根据权利要求 1 所述的基于核酸的生物逻辑门与逻辑电路的构建方法，其特征在于：利用步骤（f） 中 G-四联体、H₂O₂、ABTS 的用量体积为 1:2:2，其中 H₂O₂ 和ABTS 的用量均为 2 mmol/L。

10.根据权利要求 1 所述的基于核酸的生物逻辑门与逻辑电路的构建方法，其特征在于：利用步骤（g） 中所应用的电路组合方式为 YES 门与 OR 门串联后并联 AND 门。