[发明专利]一种N-糖酰胺酶的酶活力测定方法

权利要求书

1.一种N-糖酰胺酶的酶活力测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)还原糖标准曲线的制备：将还原糖标准品稀释成一系列的浓度标准液，于各浓度标准液中加入三氯乙酸溶液、氢氧化钠溶液、WST-1显色溶液，混匀后40-60℃显色50-60min，使用酶标仪在584nm处测定反应液吸光值，得到还原糖浓度与吸光度关系曲线；

(2)N-糖酰胺酶水解糖蛋白底物反应：将糖蛋白标准品用水稀释，加热变性，冷却后加入pH缓冲液和不同浓度的N-糖酰胺酶反应；

(3)N-糖酰胺酶水解糖蛋白产物测定：步骤(2)N-糖酰胺酶水解糖蛋白反应液中加入三氯乙酸溶液终止反应，离心取上清液；加入氢氧化钠溶液，再加入WST-1溶液40-60℃显色50-60min小时，使用酶标仪在584nm处测定反应液吸光值，反应零分钟为空白对照；根据吸光值与还原糖标准曲线可得到N-糖酰胺酶酶解产物浓度，从而计算酶活性。

2.根据权利要求1所述的N-糖酰胺酶的酶活力测定方法，其特征在于，步骤(1)所述还原糖标准品为糖链末端具有还原性的糖。

3.根据权利要求1所述的N-糖酰胺酶的酶活力测定方法，其特征在于，步骤(1)所述一系列的浓度为10μmol/L到200μmol/L之间的任意系列浓度。

4.根据权利要求1所述的N-糖酰胺酶的酶活力测定方法，其特征在于，步骤(1)或步骤(3)中的显色温度为45-55℃，显色时间为60min。

5.根据权利要求1所述的N-糖酰胺酶的酶活力测定方法，其特征在于，步骤(1)或步骤(3)中的氢氧化钠溶液的浓度为4-5mol/L，优选4mol/L。

6.根据权利要求1所述的N-糖酰胺酶的酶活力测定方法，其特征在于，步骤(1)或步骤(3)中的三氯乙酸溶液的浓度为2-3mol/L，优选2.5mol/L。

7.根据权利要求1所述的N-糖酰胺酶的酶活力测定方法，其特征在于，步骤(2)中的糖蛋白标准品为辣根过氧化物酶、核糖核酸酶、鸡卵清蛋白、牛胎球蛋白或牛转铁蛋白。

8.根据权利要求1所述的N-糖酰胺酶的酶活力测定方法，其特征在于，步骤(2)中的pH缓冲液为pH 2.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。