[发明专利]一种基于固相连接CRISPR/Cas9gRNA串联表达载体构建新技术

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于固相连接的CRISPR/Cas9 gRNA串联表达载体构建新技术，应用在CRISPR/Cas9介导的多gRNA表达载体在细胞及动物模型等基因组编辑技术中的应用。

背景技术

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9技术是一种继锌指核酸酶(ZFN)和TALEN技术之后可用于精确修改基因组DNA的崭新的基因组编辑技术。其具有效率高、速℃快及简单经济的特点，在细胞及动物基础研究及实验模型的构建方面的应用前景都非常广阔^[1]。

目前，来自Streptococcus pyogenes的CRISPR/spCas9系统和来自Staphylococcus aureus的CRISPR/saCas9应用最为广泛。Cas9蛋白含有核酸酶结构域，可以切割DNA双链。Cas9首先与guide RNA(gRNA)结合成复合物，然后通过PAM(Protospacer Adjacent Motif)序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂^[2,3。

gRNA作为Cas9结合到目的DNA的关键识别序列,gRNA的设计决定了Cas9-gRNA复合体最终的切割效率。通常gRNA由聚合酶III型启动子如U6，H1转录获得成熟gRNA序列。然而单gRNA表达载体已经很难满足当前实验的需求，能快速、高效地构建同时表达多个gRNA的多gRNA表达载体的需求已经非常迫切。多gRNA表达载体的需求和优势主要体现在以下几个方面：

1)筛选最优的目标DNA靶点，针对一个靶点通常需要设计3条或者3条以上的gRNA序列；2)用于筛选效率高的gRNA靶点，单gRNA表达载体需要构建3个或3个以上，周期长，实验繁琐；3)需要同一次针对多个目标DNA靶点；4)针对一个靶点同时使用多条gRNA，用以提高最终切割效率。

对比单gRNA表达载体，多gRNA表达载体只需构建一次，通过测序同样可以筛选到最优的gRNA，同时可以提高导入效率，提高细胞或动物模型的阳性率。此外，目前主流方案都已经应用病毒技术表达Cas9及gRNA，多个载体意味着包装更多的病毒，经济成本和时间成本都会成倍增加。由此可见在单一载体同时表达多个gRNA将极大提高CRISPR/Cas9的应用空间，降低成本，提高效率。目前主要的多gRNA表达载体的构建方案为每次构建一个gRNA，分多次构建完成，这样包含3个gRNA的载体的整个构建周期长达15d以上。为了解决构建周期问题，有研究者采用了tRNA剪切的策略表达多个gRNA^[4]，但是该方案操作复杂，并没有解决构建周期的根本问题，所以并没有得到广泛应用。

本发明基于链霉亲和素磁珠的固相连接方法将构建3-4个gRNA到单载体的连接步骤缩短到1d内就可以完成，极大地提高了效率，节省了大量时间和经济成本。

参考文献

1.Estrela R,Cate JH.Energy biotechnology in the CRISPR-Cas9 era.Curr Opin Biotechnol.2016Feb 10；38:79-84.

2.Mali P,Yang L,Esvelt KM,Aach J,Guell M,DiCarlo JE,Norville JE,Church GM.RNA-guided human genome engineering via Cas9.Science.2013 Feb 15；339(6121):823-6.

3.Cong L,Ran FA,Cox D,Lin S,Barretto R,Habib N,Hsu PD,Wu X,Jiang W,Marraffini LA,Zhang F.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Science.2013 Feb 15；339(6121):819-23.

4.Xie K,Minkenberg B,Yang Y.Boosting CRISPR/Cas9multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system.Proc Natl Acad Sci U S A.2015 Mar 17；112(11):3570-5。

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