[发明专利]Apoe基因敲除的动物模型的构建方法及其短肽

说明书

本发明提供一对短肽、一对转录激活子样效应因子、一对DNA载体，本发明所述的短肽能够对大鼠Apoe基因进行准确、高效的打靶，快速获得Apoe基因敲除大鼠。本发明还提供了一种敲除Apoe基因的方法以及一种Apoe基因敲除的动物模型的构建方法，本发明的敲除Apoe基因的方法敲除基因结果更为可靠，并且可实现在大鼠成年初期即表现出高血脂特征。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一对短肽、一对转录激活子样效应因子及敲除Apoe基因的方法、构建Apoe基因敲除的动物模型的的方法。

背景技术

ApoE蛋白是一种载脂蛋白，存在于极低密度脂蛋白、乳糜微粒、中间密度脂蛋白和高密度脂蛋白中，主要在肝脏和脑组织中合成，参与脂蛋白的转化与代谢过程，是脂类代谢中的重要配体。已有研究表明ApoE基因缺陷或基因变异与心血管疾病、阿尔兹海默症、年龄相关性黄斑变性等疾病有关，是高胆固醇血症和动脉粥样硬化的主要基因。

全世界范围内针对人类不同疾病进行治病机理研究和药物开发从未停止，但由于受到人类自身伦理和技术实现的限制，很多研究不能在人类自体上直接进行，而需要在与人类相近的动物体上进行实验。因此，为进一步研究ApoE基因，进而为人类疾病治疗提供理论依据，早在1992年，Andrew和Zhang等人分别使用胚胎干细胞基因敲除技术成功培育了Apoe-/-小鼠(Plump,A.S.et al.Cell 71:343-353,1992，Zhang,S.H.et al.Science 258:468-471,1992.)，这些小鼠即使在低脂肪、低胆固醇饮食中也表现出严重的高胆固醇血症；通过饲喂含胆固醇的高脂饮食，Apoe-/-小鼠可出现明显的自发性动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)斑块。此后，人们还制备了多种Apoe基因或多基因敲除及修饰小鼠，并在Apoe基因功能研究和作为疾病模型得到广泛应用。

但是，上述模型多采用有肥胖倾向的C57BL/6小鼠为背景进行改造，研究表明，针对C57BL/6小鼠使用高脂饲料4周即可形成肥胖模型(刘芳等，中国药理学通报，2013Mar 29(3)：360-5)，因此，C57BL/6小鼠本身具有一定偏好性，制备C57BL/6小鼠的敲除Apoe基因模型的方法很难应用于其它品系动物模型的制备。

大鼠作为啮齿类模式动物，已经成为人疾病相关基础研究和药物开发不可或缺的动物模型。近年来通过基因工程技术改造大鼠特定基因从而得到特定基因型和表型的模式大鼠已经成为研究热点。与小鼠模型相比，大鼠在解剖、生理方面与人相似，生长代谢快，更为重要的是，大鼠脑体积和体型更大，而动脉粥样硬化等疾病研究需涉及解剖心脑血管操作，大鼠更容易进行手术操作，尤其是在血管腔内的操作；大鼠可采血量大，也可以动态监测大鼠动脉粥样硬化过程中血液学指标的变化过程。虽然，一直以来大鼠都是药理学研究的首选动物，并且被广泛应用于心血管疾病、神经性疾病的研究领域，但是由于胚胎干细胞提取和培养方法在大鼠上还未成熟，利用传统胚胎干细胞打靶方法制备大鼠基因敲除模型比较困难。

针对上述问题，中国期刊《实验动物与比较医学》(Aug.2015，35(4):277-282)中公开的《应用Talen法制备Apoe基因敲除大鼠模型》提出了解决方案，通过Talen法得到了敲除Apoe基因的大鼠模型。但是，上述方法仍存在以下问题：(1)仅在第二外显子缺失了1个碱基，虽然也造成了移码突变，且经检测无Apoe蛋白表达，但仍存在由排在缺失碱基之后的起始密码子恢复Apoe蛋白表达的可能(因密码子排列顺序不唯一的特性，编码序列中任何一个编码甲硫氨酸的密码子都可能成为起始密码子，启动后续DNA的转录和蛋白翻译)；(2)采用上述方法构建的大鼠模型仅在大月龄的大鼠(6-7个月龄)中表现出血脂中胆固醇水平高的特征，并不能确定是否与Apoe基因敲除或基因序列缺失程度有关，而SD大鼠在2个月就达到性成熟，该模型也未能在SD大鼠发育成熟早期表现出高血脂特征，导致相关研究的不完善。需要建立更好的模型进行进一步验证Apoe基因敲除与高血脂的相关性。

发明内容