[发明专利]一种邻苯二醛衍生物亚磷酰胺单体、合成方法及DNA快速偶联蛋白质的方法

权利要求书

1.邻苯二醛衍生物亚磷酰胺单体，分子式为C₂₈H₄₆N₃O₆P，其结构式如下：

2.如权利要求1所述的邻苯二醛衍生物亚磷酰胺单体的用途，用于DNA与蛋白质的偶联。

3.如权利要求1所述的邻苯二醛衍生物亚磷酰胺单体的合成方法，包括以下步骤：

1)1)将邻苯二醛羧酸衍生物OPA-COOH、6-氨基-1-己醇、二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三氮唑按照摩尔比1：1.5-2.5：1-2：1-2混合，抽排除去空气，加入溶剂四氢呋喃搅拌反应，反应时间为12～24h；而后过滤除去沉淀，再分离纯化，得到邻苯二醛羟基衍生物OPA-OH；其中，OPA-COOH及OPA-OH结构式分别如下：

2)在氮气保护下，将OPA-OH和N，N-二异丙基乙胺混合，用二氯甲烷溶解，再加入2-氰乙基-N，N-二异丙基氯代亚磷酰胺，搅拌反应后用硅胶柱层析分离纯化，得到邻苯二醛衍生物亚磷酰胺单体，其中，所述OPA-OH、2-氰乙基-N，N-二异丙基氯代亚磷酰胺、N，N-二异丙基乙胺的摩尔比为1:1-2:2-5。

4.如权利要求3所述一种邻苯二醛衍生物亚磷酰胺单体的合成方法，其特征在于步骤1)，加入的溶剂的体积为溶质的1-20倍。

5.如权利要求3所述一种邻苯二醛衍生物亚磷酰胺单体的合成方法，其特征在于步骤2)，所述反应温度为20-30℃，反应时间为1-5h。

6.DNA快速偶联蛋白质的方法，包括如下步骤：

1)合成权利要求1所述的邻苯二醛衍生物亚磷酰胺单体；

2)在DNA的5’端修饰邻苯二醛衍生物亚磷酰胺单体；

3)在缓冲液的条件下，将5’端修饰邻苯二醛衍生物亚磷酰胺单体的DNA和蛋白质室温孵育0.5-3小时。

7.如权利要求6所述DNA快速偶联蛋白质的方法，其特征在于缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。

8.如权利要求6所述的DNA快速偶联蛋白质的方法，其特征在于：

步骤2)包括以下步骤：

1)CPG作为固相载体，以正常的DNA单体碱基作为原料，在DNA合成仪上由3’端到5’端合成DNA序列，然后在DNA的5’端修饰邻苯二醛衍生物亚磷酰胺单体；

2)加入甲胺/氨水，65℃条件下孵育30min将OPA-DNA产物从CPG上切割下来；

3)利用反相色谱进行分离纯化，所用流动相为0.1M醋酸三乙胺和乙腈；

4)利用20％三氟乙酸/二氯甲烷(v/v)，脱去醛基保护，而后抽干去除。

9.如权利要求8所述邻苯二醛衍生物亚磷酰胺单体修饰合成OPA-DNA，其特征在于步骤4)，所述20％三氟乙酸/二氯甲烷(v/v)脱去醛基保护之前，先用脱盐柱脱盐纯化。