[发明专利]猪伪狂犬病焦磷酸测序检测方法及专用引物

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种猪伪狂犬病焦磷酸测序检测方法及专用引物。

背景技术

猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的多种家畜和野生动物均可感染的急性传染病，以发热、流产、死产、奇痒(猪除外)和脑脊髓炎为主要症状，其中对猪的危害最大，且猪是唯一的自然宿主。该病1813年首次发生于美国，随后波及欧美等国家地区，现该病已呈世界性流行。自2012年下半年以来，我国PR发病率明显上升，对养猪业造成了重大的经济损失。

猪伪狂犬病病毒属于疱疹病毒科，又称猪疱疹病毒Ⅰ型。迄今为止，在猪伪狂犬病毒中已经发现了11种糖蛋白，其中，除gG是外分泌蛋归之外，其它10种结构蛋白均定位于囊膜上。其中gD是PRV的主要结构蛋白，它不但诱导体液免疫，而且诱导细胞免疫，同时是病毒粒子表面的病毒感染细胞的主要分子，在病毒吸附和侵入宿主细胞过程中发挥重要作用。

传统的疫病病原诊断方法包括病毒分离与鉴定、分子生物学等方法在疫病的检测方法发挥了巨大的作用，但同时也具备一些无法满足快速准确的检测要求的缺陷，即无法获得分子诊断的黄金标准——基因序列，从而可能造成假阳性的结果。如需要进行阳性结果确认，则必须将所扩增目的片段连接于特定的测序载体上，转化、挑取阳性克隆后才能得以完成测序确证，费时耗力。

焦磷酸测序技术是近年来较为先进的定量序列测定的短链测序技术，能够实现高通量样品直观的序列分析。通过焦磷酸测序技术可以获得分子诊断的黄金标准——基因序列，避免了假阳性结果的出现；尤其使得在不具备兽医生物安全级别的实验室，可以运用该方法对病毒快速鉴定分型。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测猪伪狂犬病毒的成套引物。

本发明提供的成套引物，包括如下引物对：

所述引物对由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成。

上述成套引物中，所述引物对中的一条引物末端生物素标记。

上述成套引物中，所述成套引物还包括核苷酸序列为序列表中序列3的测序引物。

含有上述成套引物的成套PCR试剂或含有所述成套引物或所述成套PCR试剂的试剂盒也是本发明保护的范围；

或序列4第81-135位所示的DNA分子也是本发明保护的范围；。

上述的成套PCR试剂中，

所述成套PCR试剂由PCR试剂1和PCR试剂2组成；

所述PCR试剂1为含有上述成套引物中所述引物对的试剂；

或，所述引物对中每条引物在所述PCR试剂1中的浓度为20μM；

所述PCR试剂2为含有上述成套引物中所述测序引物的试剂；

或，所述测序引物在所述PCR试剂2中的浓度为0.3μM。

上述成套引物或上述的成套PCR试剂或试剂盒或序列4第81-135位所示的DNA分子在检测或辅助检测猪伪狂犬病毒中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述成套引物或上述的成套PCR试剂或试剂盒或序列4第81-135位所示的DNA分子在制备检测或辅助检测猪伪狂犬病毒产品中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述成套引物或上述的成套PCR试剂或试剂盒或序列4第81-135位所示的DNA分子在检测或辅助检测待测样本中是否含有猪伪狂犬病毒中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述成套引物或上述的成套PCR试剂或试剂盒或序列4第81-135位所示的DNA分子在制备检测或辅助检测待测样本中是否含有猪伪狂犬病毒产品中的应用也是本发明保护的范围。

本发明另一个目的是提供一种检测或辅助检测待测样本中是否含有猪伪狂犬病毒的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)用序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对对待测样本进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

2)用核苷酸序列为序列表中序列3的测序引物对所述PCR扩增产物进行焦磷酸测序，得到PCR扩增产物测序结果；

若所述PCR扩增产物测序结果与序列4第81-135位所示的DNA分子的同源性大于等于80％，则所述待测样本中含有或候选含有猪伪狂犬病病毒，若所述PCR扩增产物测序结果与序列4第81-135位所示的DNA分子的同源性小于80％，则所述待测样本中不含有或不候选含有猪伪狂犬病病毒。

本发明第3个目的是提供一种检测或辅助检测待测样本中是否含有猪伪狂犬病毒的方法。