[发明专利]用于检测产气肠杆菌的LAMP引物组、试剂盒及快速检测方法

说明书

本发明公开了用于检测产气肠杆菌的LAMP引物组、试剂盒及快速检测方法。本发明的LAMP引物是根据产气肠杆菌ThdF基因设计的六条特异性引物，应用上述六条引物，可实现特异性扩增，能够有效鉴别产气肠杆菌，最低检测极限可达到1个DNA拷贝；60min内可以完成对DNA样品的检测；且可根据实际情况灵活选择检测方法，方便快捷，有非常广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及用于检测产气肠杆菌的引物组、试剂盒及快速检测方法。

背景技术

肠杆菌属现有15种，其中产气肠杆菌是最常见的一种，是肠道正常菌丛的一部分，认为不会引起腹泻，广泛存在于自然环境中，在人和动物的粪便水、泥土、植物中均可检出，但能引起多种肠道外的条件致病性感染，如泌尿道、呼吸道和伤口感染，亦可引起菌血症和脑膜炎。

传统的产气肠杆菌检测主要通过生化鉴定和普通PCR。其中，生化鉴定需要对细菌进行纯培养后配成相当浓度的菌液后加到商业化的生化鉴定板，前后需要时间在2天以上。普通PCR则需要变性-退火-延伸3个阶段，即反应过程需要专业PCR仪控温，扩增后需要电泳仪判读结果。这些耗时长、操作繁琐及需要昂贵的仪器设备的方法都限制了产气肠杆菌的现场检测的发展，因此，开发一种简便、快捷的产气肠杆菌的检测方法具有极大的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供用于检测产气肠杆菌的引物组；

本发明的另一个目的在于提供用于检测产气肠杆菌的试剂盒；

本发明的另一个目的在于提供产气肠杆菌的快速检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

用于检测产气肠杆菌的LAMP引物组，所述LAMP引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

ThdF-F3: 5’-GCGATCGTCACCGATATC-3’；

ThdF-B3: 5’-GGTAATCGGCAGCTTAGC-3’；

ThdF-FIP: 5’-CCACTTCATCACTGGCGTCAATTCACATCGACGGTATGC-3’；

ThdF-BIP: 5’-GCGAATCGGCATTGAACGCGCCGTCGACCATAAACAG-3’；

ThdF-LF: 5’-GCCTGCGGTATCGATGATAT-3’；

ThdF-LB: 5’-ATTGAACAGGCGGATCGG-3’。

用于检测产气肠杆菌的试剂盒，包括上述的LAMP引物组。

作为上述试剂盒的优选，LAMP引物组中，外引物、内引物、环引物的摩尔比为：(1～2)：(4～8)：(2～4)。

作为上述试剂盒的改进，还包括以下成分：DNA聚合酶、反应液、显色剂、荧光染料、封闭液、阳性对照和阴性对照。

作为上述试剂盒的优选，反应液为含有20mM pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、10mM氯化钾、10mM硫酸铵、8mM硫酸镁、0.1%曲拉通X-100、甜菜碱0.8mM、4种dNTPs均2.8mM。

作为上述试剂盒的优选，荧光染料为SYBR GREEN Ⅰ。

作为上述试剂盒的优选，显色剂为钙黄绿素与锰离子配合物，钙黄绿素与锰离子配合物的混合体积比为1：10～15。

非疾病诊断目的的产气肠杆菌的快速检测方法，包括如下步骤：

（1）提取待检样品DNA；